论文摘要
背景：间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）是一类具有自我更新（self renewal）和多向分化潜能（multi-lineage differentiation）的成体干细胞。它来源广泛,可从骨髓、脂肪、脐带、脐血、胎盘等多种组织中分离得到,并且不同来源的MSCs都具有相似的免疫调节、造血支持和组织修复功能。目前MSCs对T淋巴细胞的免疫抑制作用成为MSCs对于自身免疫性疾病临床治疗应用的理论基础,但是MSCs对B淋巴细胞的免疫调节仍需要进一步的深入探讨。目的：探讨人脐带来源间充质干细胞对B淋巴细胞的增殖和终末分化的免疫调节并揭示其主要的作用机制。方法：（1）应用流式细胞技术检测脐带来源间充质干细胞免疫表型以及胚胎干细胞的全能标志物。（2）间充质干细胞三系分化诱导培养：定向诱导人脐带来源的间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化,用油红O染色、Von Kossa染色、番红O染色观测脂滴形成、钙盐沉积和胶原合成情况以鉴定人脐带来源的间充质干细胞的多向分化潜能。（3）体外建立人脐带来源的间充质干细胞和CD19+B淋巴细胞的共培养体系利用Brdu酶联免疫吸附法（Brdu ELISA试验）检测B淋巴细胞的增殖情况,并且用流式细胞检测技术检测B淋巴细胞的终末分化标志CD138的表达情况；利用酶联免疫吸附试剂盒检测B淋巴细胞IgM、IgA、IgG的分泌水平,从而反映人脐带来源的间充质干细胞对活化后的B淋巴细胞的增殖和终末分化影响。（4）用transwell24孔培养板培养人脐带来源的间充质干细胞和CD19+T淋巴细胞以研究人脐带来源的间充质干细胞发挥免疫抑制作用是否需要细胞直接接触。（5）利用酶联免疫吸附试剂盒检测共培养体系中PGE2和IL-6的分泌水平,并在共培养体系中加入PGE2合成酶的抑制剂吲哚美辛以及IL-6中和抗体,检测其增殖和IgM、IgA、IgG分泌情况以验证其主要的介导因子。（6）将6-8周BALB/c分为8组,分别标记A-H,其中A和D注射T细胞依赖性抗原Ⅰ（TNP-Ficoll）、B和E组注射T细胞依赖性抗原Ⅱ（TNP-KLH）、C和F组注射T细胞非依赖型抗原（TNP-LPS）,小鼠骨髓间充质干细胞培养至3代,A、C、E、G组注射1*106/支小鼠骨髓MSC, B、D、F组注射PBS, H组为阴性对照组。7天后收集血清并检测其IgM的分泌水平,14天后再次收集血清并检测其IgG的分泌水平。对比小鼠骨髓MSC对体内免疫球蛋白分泌的影响。结果：（1）人脐带MSCs表达CD13、CD29、CD49e、CD44、CD90、CD105、CD166和HLA-ABC（HLA-I）;均不表达造血细胞相关标志CD3、CD11b、CD14、 CD19、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD133和HLA-DR （HLA-Ⅱ）等；（2）人脐带来源的MSCs具有向脂肪细胞、骨细胞和成软骨三系分化的能力。（3）人脐带MSCs促进B细胞的增殖。（4）人脐带MSCs促进B细胞的终末分化和免疫球蛋白分泌。（5）人脐带MSCs对B细胞的作用是通过可溶性因子实现的,其中PGE2发挥重要的作用,但是IL-6未有明显的作用。（6）人脐带MSCs促进体内T细胞依赖性抗体和非依赖型抗体的产生。结论：人脐带来源MSCs促进B细胞的增殖和终末分化作用,并且MSCs是通过分泌可溶性细胞因子PGE2而非IL-6发挥着促进作用的。背景：间充质干细胞作为一种成体干细胞,其最初对MSCs的研究主要关注于其向多种组织细胞类型分化的可塑性和再生能力,但是目前更多的关注集中到MSCs免疫调节功能,且目前研究比较清楚的是对外周血单个核细胞尤其是TH1型细胞因子分泌的免疫抑制作用。虽然目前的间充质干细胞的免疫调节机制并不非常清楚,但是越来越多的研究表明间充质干细胞是通过可溶性细胞因子来实现的。故间充质干细胞是目前治疗一些免疫性疾病尤其是自身免疫性疾病的理想细胞,但是由于不同组织来源甚至不同个体来源的间充质干细胞其免疫学活性并不完全相同,目前缺乏对间充质干细胞免疫学活性检测的定量方法,而使的间充质干细胞的临床应用过于凌乱,缺乏统一性的标准。目的：探讨寻找定量检测脐带间充质干细胞免疫学活性的定量的方法,为临床的量化应用打下基础。方法：（1）)体外检测人脐带来源的间充质干细胞和健康成人外周血单个核细胞的共培养体系,利用酶联免疫吸附试验试剂盒检测其IFN-y的分泌水平,而反映人脐带来源的间充质干细胞对活化后的外周血单个核细胞免疫抑制作用。将2×105hUC-MSCs接种于6孔板,2h贴壁后换液,加或不加IL-1β培养一段时间后,收集上清。采用酶联免疫吸附法对间充质干细胞PGE2的分泌进行定量检测。（2）建立不同浓度外源性PGE2和活化的健康成人外周血单个核细胞的培养体系,采用酶联免疫吸附法检测不同浓度外源性PGE2对外周血单个核细胞IFN-y分泌进行检测,确定外源性PGE2对外周血单个核细胞IFN-Y分泌的抑制曲线。（3）将收集的上述脐带间充质干细胞培养上清50μL加入150μL成人外周血单个核细胞培养体系中,培养3天后收集上清,ELISA检测IFN-Y的分泌。结果：（1）人脐带来源的间充质干细胞能够抑制活化的外周血单个核细胞IFN-Y的分泌,并且主要是通过分泌PGE2来实现的。（2）脐带间充质干细胞在24小时时PGE2的分泌量最大,以后随时间的延长而逐渐下降。不同个体来源的脐带间充质干细胞分泌PGE2差别很大。（2）外源性PGE2以剂量依赖性抑制外周血单个核细胞IFN-y的分泌,在1ng/mL-50ng/mL的浓度范围内变化最为明显。’（3）人脐带来源间充质干细胞上清中PGE2在与外源性PGE2相同的浓度范围内能够模拟外源性PGE2对外周血单个核细胞IFN-Y分泌的抑制作用,并且不同个体来源的脐带间充质干细胞对IFN-Y分泌的抑制能力不同。结论：不同个体来源脐带间充质干细胞的免疫调节能力不同,我们将5×105脐带间充质干细胞在6孔板、2mL的培养体系中培养24小时后其上清中能否分泌20ng/mL的PGE2量定为脐带间充质干细胞免疫强弱的临界点,≥20ng/mL其免疫能力强,<20ng/mL其免疫能力弱。背景：骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs）作为骨髓造血微环境中重要的组成细胞是众多造血微环境细胞的前体细胞,其对造血干细胞的增殖分化起重要的支持作用。但是,成人骨髓间充质干细胞存在来源有限、取样时要进行侵袭性操作以及间充质干细胞的绝对数量和增殖分化能力会随着供者年龄增加而下降等不足而限制了其广泛应用。研究表明其他来源间充质干细胞同样具有造血支持作用,脐带间充质干细胞来源广泛、无伦理学限制、更强的增殖能力、长期培养和传代后仍然维持干细胞特性而成为细胞治疗中一种非常有希望的替代性干细胞,但是其造血支持能力仍有限,因此寻找加强间充质干细胞造血支持的方法成为MSC用于造血支持细胞治疗的必要。目的：本研究旨在探讨IL-1p对人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的及造血支持的影响。方法：将分离得到的hUC-MSCs（human umbilical cord mesenchymal stem cells）以2×106接种于75cm2培养瓶中,贴壁2小时后,加入1Ong/mL IL-1β （interleukin1β）培养36小时后收集培养上清和细胞。观察有/无IL-1β的条件培养基对CD34+细胞粒系集落形成单位（Colony-Forming Unit-Granulocyte, CFU-G）、巨噬系集落形成单位（Colony-Forming Unit-Macrophage CFU-M）和粒-巨噬集落形成单位（Colony-Forming Unit-Granulocyte Macrophage, CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（Burst Forming Unit-Erythroid, BFU-E）、红系集落形成单位（Colony-Forming Unit-Erythroid CFU-E）和粒红单巨核集落形成单位（Colony-Forming Unit-Granulocyte/Erythroid/Macrophage/Monocyte CFU-GEMM）的集落形成能力的影响；实时定量PCR（real time PCR）检测加／不加IL-1β hUC-MSCs的造血相关因子G-CSF. GM-CSF、M-CS、IL-6、SOD2、CDK6、TRIM22mRAN的变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测造血相关因子GM-CSF、M-CSF、IL-6蛋白浓度的差异。结果：①含有IL-1p的hUC-MSCs条件培养基能明显增强CD34+细胞集落形成能力,且以粒系和粒-单核集落形成单位为主；②IL-1p促进hUC-MSCs GM-CSF、G-CSF、IL-6的mRNA的表达；③IL-1p促进hUC-MSCs GM-CSF、M-CSF、IL-6蛋白水平的分泌。结论：IL-1β能够增强hUC-MSCs的造血支持能力尤其是向髓系分化的能力。
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