亚洲玉米螟整合素在血细胞包囊外源物过程中的功能研究

论文摘要

包囊反应是昆虫清除体内大量病原微生物和大的生物外源物如寄生虫、寄生蜂卵等的有效手段,它需要昆虫血细胞尤其是粒细胞和浆细胞的参与,而浆细胞形态的改变是形成包囊的必要条件。整合素（integrin）是一类普遍存在于细胞表面的跨膜糖蛋白,是连接细胞外基质和细胞内环境信号转导的纽带。在昆虫中整合素对果蝇的生长发育及一些鳞翅目昆虫的先天性免疫反应起重要作用。本研究在已经克隆得到亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）Integrinβ1 cDNA（命名为Ofintβ1）全长序列的基础上,以亚洲玉米螟幼虫为试虫,初步分析了Ofintβ1的组织分布及其在调控浆细胞形态变化及血细胞包囊外源物过程中的作用。为在蛋白水平上对Ofintβ1进行检测,克隆了胞外域靠近5’端一个408 bp的cDNA片段（aa# 174-309）,其中包含一个配体结合位点（aa# 173-177）。将Ofintβ1片段连接到表达载体pET-32a上,阳性重组子转化表达宿主菌BL21（DE3）中,在IPTG诱导下进行了高效表达。SDS-PAGE检测表明Ofintβ1在大肠杆菌中可表达分子量约为27.6 kDa的可溶性融合蛋白,Western blot分析表明表达产物能与抗6His单抗特异性结合,即表达的OfINTβ1为C端带有6His标签的融合蛋白。将经Ni-NTA亲和柱纯化的OfINTβ1融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备了抗OfINTβ1的兔血清（命名为Anti-OfINTβ1）,ELISA效价达12 800以上。Western印迹检测结果表明,制备的抗血清可以特异识别表达的融合蛋白OfINTβ1。为检测Ofintβ1的组织表达差异性,提取了亚洲玉米螟5龄中期幼虫的血细胞、脑、表皮、脂肪体、中肠、马氏管、气管7个组织的总RNA,利用RT-PCR进行了转录水平上的检测,结果只在血细胞中检测到Ofintβ1的特异性表达带,而在其它组织中未检测到该基因转录本的存在。不同组织的Western blot分析表明,诱导和未诱导的血细胞蛋白粗提液中均有OfINTβ1表达。血细胞免疫荧光定位实验结果也表明,Anti-OfINTβ1可以与血细胞特异性结合。用不同稀释倍数的抗OfINTβ1兔血清封闭细胞表面表达的OfINTβ1蛋白,结果表明血细胞对载玻片的粘附能力因抗血清浓度的不同而不同。粘附30 min后,2倍稀释的抗血清封闭的血细胞有明显的聚集,很难观察到血细胞粘附能力的变化;5倍与10倍稀释的抗血清封闭的浆细胞对载玻片的粘附能力受到明显抑制;而100倍稀释的抗血清对浆细胞的黏附能力无明显抑制作用,血细胞的状态与对照血清及Pringle’s saline处理的结果基本相同。说明OfINTβ1在调控浆细胞形态变化和血细胞粘附过程中起了关键作用。为进一步分析Ofintβ1在血细胞包囊外源物过程中的功能,使用了RNA干扰的方法。首先,构建了重组载体L4440-Ofintβ1,在大肠杆菌HT115（DE3）中诱导表达dsRNA,以期通过饲喂细菌表达的dsRNA来研究Ofintβ1的功能,但没有获得明显的干扰效果。之后,在体外人工合成dsRNA,注射到幼虫体内进行RNAi。结果表明在4龄末期注射dsRNA的处理中,经过一次蜕皮后可检测到血细胞对外源物的包囊作用被明显抑制,初步证明Ofintβ1在包囊反应过程中起关键作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 昆虫的天然免疫反应
• 1.1.1 昆虫体液免疫反应
• 1.1.2 鳞翅目昆虫血细胞的分类与特征
• 1.1.3 昆虫细胞免疫反应
• 1.2 整合素
• 1.2.1 整合素的结构概述
• 1.2.2 整合素的信号转导机制
• 1.2.3 整合素在昆虫学中的研究进展
• 1.2.4 亚洲玉米螟Integrin β1 基因
• 1.3 RNA 干扰原理及应用
• 1.3.1 RNAi 的发现
• 1.3.2 RNAi 的作用机制与特点
• 1.3.3 RNAi 的研究进展
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 OfINT β1 多克隆抗体的制备与检测
• 2.1.1 实验材料与仪器设备
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 Ofint βl 基因组织特异性表达分析
• 2.2.1 实验材料与仪器设备
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 Ofint βl 在包囊外源物过程中的功能分析
• 2.3.1 实验材料与仪器设备
• 2.3.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 OfINT β1 多克隆抗体的制备与检测
• 3.1.1 pET32a-OfINT β1 重组表达载体的构建
• 3.1.2 pET32a-OfINT β1 的原核诱导表达及蛋白的纯化
• 3.1.3 多克隆抗体的制备与检测
• 3.2 亚洲玉米螟 Integrin β1 基因组织特异性表达分析
• 3.2.1 RT-PCR 检测各组织Ofint β1 表达情况
• 3.2.2 Western blot 方法检测各组织OfINT β1 的表达
• 3.2.3 免疫荧光定位检测OfINT β1 在血细胞中的表达
• 3.3 Ofint β1 在包囊外源物过程中的功能分析
• 3.3.1 多克隆抗体处理的血细胞粘附实验
• 3.3.2 构建表达dsRNA 的重组载体L4440-Ofint β1
• 3.3.3 饲喂法RNA 干扰
• 3.3.4 注射法RNA 干扰
• 4 讨论
• 4.1 多克隆抗体 Anti-OfINT β1 的制备
• 4.2 Integrin β1 基因的组织分布
• 4.3 Integrin β1 基因在鳞翅目昆虫中的功能
• 4.4 RNA 干扰方法及时间
• 5. 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文