基于简化氨基酸的肌激酶表达、纯化、结晶与初步功能研究

论文摘要

蛋白质的起源机制是生命起源研究最有挑战性的问题之一。基于小分子配体的保守性,我们实验室提出蛋白质起源的小分子诱导、选择模型,认为最早产生的蛋白质是ATP等小分子诱导和选择的结果。为了对该模型进行实验验证,采用“自上而下（Top-Down）"的策略,设计完全由存在于原始环境中的简化氨基酸组成的蛋白序列,并对该理论设计的序列进行表达、纯化、结晶。我们选取大肠杆菌肌激酶的序列为模板,前期工作已完成氨基酸的简化,得到了新的序列,本文针对这一理论设计的蛋白进行了表达、纯化、结晶和初步的功能研究,主要结果如下：（1）利用分子克隆技术,构建融合表达载体。将设计的氨基酸序列转化为核苷酸序列,添加NdeⅠ/XhoⅠ为酶切位点,优化密码子后人工合成全长的基因375bp,并将这段基因克隆到载体pET28b上,构建表达载体pET28b-cAK,导入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中。（2）目的蛋白表达和纯化。对构建成功的表达载体,从诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等方面进行了条件优化,而且进行了高效自诱导表达。结果表明：目的蛋白（命名为cAK）可以进行可溶性表达,而且表达量很高,自诱导表达的目标蛋白质的量是普通IPTG诱导表达的8-10倍。对融合蛋白进行了两步IMAC纯化,Thrombin酶切,获得了高纯度的cAK蛋白。（3）cAK结晶条件的筛选。我们对cAK自由态以及与小分子形成的复合态分别进行了结晶条件的初步筛选,获得了三个结晶条件,为后续结构研究奠定了基础。（4）初步探讨了小分子与cAK之间的相互作用。通过CD测定,我们发现小分子的加入使蛋白质构象发生了明显变化。另外发现ADP的加入增强了cAK自身的稳定性,使其在室温的降解速率显著变慢。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词索引
• 目录
• 第一章 引言
• 1.1 化学进化学说
• 1.2 氨基酸起源研究
• 1.3 密码子起源研究
• 1.4 氨基酸起源顺序研究
• 1.5 原始蛋白起源相关研究
• 1.6 研究内容
• 第二章 简化氨基酸肌激酶蛋白的融合表达纯化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种和质粒
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 试验相关溶液配制
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 抗生素配制
• 2.2.6 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 SDS碱裂解法制备质粒DNA
• 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.3 表达载体的构建
• 2.3.4 外源基因的IPTG诱导表达
• 2.3.5 外源基因的高效自诱导表达
• 2.3.6 细胞破碎
• 2.3.7 重组蛋白的可溶性分析
• 2.3.8 外源蛋白的检测
• 2.3.9 IMAC纯化蛋白质
• 2.3.10 透析与浓缩
• 2.3.11 组氨酸标签的切除
• 2.3.12 BCA法测定蛋白质浓度
• 2.4 结果分析
• 2.4.1 重组质粒的构建
• 2.4.2 重组质粒的鉴定
• 2.4.3 cAK蛋白的IPTG诱导表达
• 2.4.4 cAK蛋白的高效自诱导表达
• 2.4.5 可溶性分析
• 2.4.6 IMAC纯化
• 2.4.7 Thrombin酶切
• 2.4.8 Western鉴定
• 2.4.9 Far-western鉴定
• 2.5 小结
• 第三章 cAK蛋白的结晶
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验试剂
• 3.2.2 实验器材
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 Native-PAGE
• 3.3.2 PCT实验
• 3.3.3 BCA检测蛋白质浓度
• 3.3.4 cAK晶体生长
• 3.4 结果分析
• 3.4.1 蛋白质均一性鉴定
• 3.4.2 cAK的晶体生长
• 3.5 小结
• 第四章 小分子与cAK蛋白相互作用的初步研究
• 4.1 引言
• 4.1.1 紫外差光谱
• 4.1.2 荧光和荧光偏振
• 4.1.3 圆二色谱法
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 实验试剂
• 4.2.2 实验器材
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 CD光谱测定
• 4.3.2 ATP/ADP对蛋白质稳定性的初步研究
• 4.4 结果分析
• 4.4.1 CD光谱测定
• 4.4.2 ATP/ADP对蛋白质稳定性的初步研究
• 4.5 小结
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 硕士研究生期间发表的文章
• 致谢