论文摘要
丝状真菌三孢布拉霉（Blakeslea trispora）是目前大规模工业化生产天然β-胡萝卜素的主要菌种,而雨生红球藻是一种目前比较理想的合成天然虾青素的藻类,在多种逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累虾青素。β-胡萝卜素在β-胡萝卜素羟化酶和酮化酶的作用下转变为虾青素。本研究中,我们通过基因工程手段,将雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因和羟化酶基因导入到三孢布拉霉中,在建立三孢布拉霉转化体系的同时,有望延长三孢布拉霉的代谢流至虾青素。目前三孢布拉霉的基因转化体系还鲜有成功的报道,本研究首次从CaCl2/PEG介导的原生质体转化、根癌农杆菌和基因枪介导的基因转化三个方面来建立三孢布拉霉的转化体系。（1）克隆雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶Crt-W和羟化酶基因Crt-Z以及三孢布拉霉双向启动子;采用融合PCR的方法将酮化酶、羟化酶基因和三孢布拉霉双向启动子构建融合片段后插入到表达载体pCAMBIA1303中,形成pCAMBIA1303-WPZ载体;（2）建立了三孢布拉霉原生质体的制备及转化体系。其结果为:混合酶溶壁酶、溶菌酶、纤维素酶以及蜗牛酶（比例为0.5:0.25:0.25:1）,酶解缓冲液的pH为67,将菌龄为16 h的幼嫩菌丝酶解4 h后,得到的原生质体数量最多;利用CaCl2/PEG介导的原生质体转化但并未筛选到阳性转化子;（3）研究根癌农杆菌介导的三孢布拉霉的转化,初步确定了转化体系:农杆菌的生长浓度为OD600=0.5,乙酰丁香酮浓度为200μg/mL,共培养的温度为28℃,时间为48 h;（4）也研究基因枪介导的三孢布拉霉的转化,确定了转化体系的轰击参数为:氮气压力为1100 psi,真空压力为-12 psi,靶距离为6.5 cm,轰击次数为1次。比较上述三种基因转化方法,农杆菌和基因枪介导的三孢布拉霉转化体系是较为有效且稳定的转化体系,获得了有绿色荧光蛋白表达的阳性转化子。