Leptin对脂肪细胞分化中perilipin、ADRP和TIP47表达的调控及其机理的初步研究

论文摘要

脂肪组织是动物机体最主要的储能组织,当有机体缺乏能量时,为机体提供必要的能量。脂肪组织代谢是一个复杂而精细的调控过程,在此过程中,脂肪生成与脂肪分解都具有不可忽视作用,如脂肪生成相关酶有FAS、ACC和SCD等;脂肪分解相关酶有ATGL、HSL和TGH等,另外,对脂代谢具有分子开关作用的perilipin及其家族ADRP和TIP47对脂肪代谢也有重要调控作用。此外,脂肪细胞内转录因子（PPARγ、LXR、RXR等）和信号通路中蛋白质相互作用及作用方式也对脂肪代谢具重要作用。本试验以1-3日龄仔猪和15日龄SD大鼠为实验材料,分离培养原代前体脂肪细胞,通过油红O染色、半定量RT-PCR技术及JAK-STAT3、MEK/ERK及PPARγ特异性抑制剂和PPARγ激活剂联合Leptin处理的方法,在体外研究了脂滴相关蛋白和脂肪生成相关酶的时序表达及Leptin对perilipin、ADRP、TIP47和PPARγmRNA表达的调控,并初步探讨其分子机制。主要研究结果如下:1.利用半定量RT-PCR法检测,perilipin在皮下脂肪组织表达最高,其次是肌肉,在脾、胃、肾、肝和心脏组织均未检测到其mRNA表达;2.半定量RT-PCR检测长白猪和八眉猪皮下脂肪组织中perilipin、ADRP、TIP47、ACCα、LXRα、FAS、SCD、PPARγmRNA的表达。结果:八眉猪perilipin、SCD mRNA表达显著低于长白猪,八眉猪TIP47、FAS和LXRαmRNA表达显著高于长白猪;3.通过半定量RT-PCR法检测原代培养猪脂肪细胞2、4、6、8、10、12、14d脂滴相关蛋白和脂肪合成相关酶mRNA的时序表达。结果,随着脂肪细胞分化perilipin、ADRP、TIP47、ACCα、LXRα、FAS和SCD mRNA总体趋势是逐渐升高;4.当Leptin处理猪脂肪细胞3 h时:150 nmol/L Leptin处理perilipin mRNA表达显著降低,50和100 nmol/L Leptin处理3 h PPARγ,ACCα和FAS mRNA表达显著降低。当Leptin处理猪脂肪细胞6 h时:50和100 nmol/L Leptin处理降低perilipin、SCD、PPARγ、FAS、ACCα和LXRαmRNA表达,50,100,150 nmol/LLeptin处理显著下调ADRP mRNA表达,50 nmol/L Leptin处理6h TIP47 mRNA表达下降;5.通过JAK-STAT3信号通路的特异性抑制剂AG490 20μmol/ml、MEK信号通路的特异性抑制剂U0126 20μmol/ml、PPARγ激动剂罗格列酮（Ros）3μmol/ml和PPARγ抑制剂GW9662 10μmol/ml分别与50ng/ml leptin共同处理大鼠脂肪细胞3h,通过RT-PCR检测perilipin、ADRP、TIP47和PPARγmRNA的表达。结果发现:AG490抑制50ng/ml Leptin对大鼠脂肪细胞perilipin mRNA表达的抑制作用（P＜0.05）;而PPARγmRNA差异不显著,暗示Leptin通过JAK-STAT3通路抑制perilipin mRNA的表达,但是Leptin并不是通过JAK-STAT3通路抑制PPARγmRNA表达;U0126阻断MEK/ERK通路加剧Leptin对体外培养大鼠脂肪细胞perilipin、ADRP和PPARγmRNA的表达下调作用;U0126抑制Leptin对大鼠脂肪细胞TIP47 mRNA的抑制作用（P＜0.05）,抑制MEK/ERK通路抑制perilipin mRNA的表达;Ros逆转Leptin对大鼠脂肪细胞perilipin、ADRP和TIP47 mRNA的抑制作用（P＜0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 PAT家族蛋白在细胞内脂滴代谢过程中的作用
• 1.1 脂肪细胞和脂滴概述
• 1.1.1 脂肪细胞和脂滴的结构
• 1.1.2 脂滴的类型和功能
• 1.1.3 脂滴的内质网合成模型
• 1.2 脂滴相关蛋白
• 1.3 PAT家族蛋白
• 1.3.1 脂滴分化相关蛋白（ADRP）
• 1.3.2 TIP47概述
• 1.3.3 S3-12概述
• 1.3.4 PAT家族的蛋白在脂滴合成过程中的转换
• 1.4 总结
• 第二章 perilipin的转录调控及在调控脂肪分解中的作用
• 2.1 perilipin的分布与结构
• 2.2 perilipin的功能
• 2.2.1 perilipin与脂肪分解
• 2.2.2 perilipin基因敲除小鼠
• 2.3 perilipin的表达
• 2.4 与perilipin转录调控相关的信号通路
• 2.4.1 PPAR γ相关信号通路
• 2.4.2 MAPKs信号通路
• 2.4.3 ERK通路
• 2.5 小结
• 试验研究
• 第三章 猪perilipin基因RT-PCR扩增体系优化及组织表达研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 脂肪组织提取总RNA的完整性
• 3.2.2 RT-PCR反应的准确性
• 3.2.3 感受态细胞转化及菌落PCR结果
• 3.2.4 退火温度（Ta）对perilipin引物扩增效率的影响
• 2浓度对perilipin和β-actin引物扩增效率的影响'>3.2.5 MgCl₂浓度对perilipin和β-actin引物扩增效率的影响
• 3.2.6 确定反应的循环次数
• 3.2.7 SQRT-PCR检测长白猪perilipin基因的组织表达
• 3.3 讨论
• 第四章 脂滴相关蛋白时序表达及Leptin对其mRNA表达的调控
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.3 统计学分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 猪原代脂肪的原代细胞培养及油红O染色鉴定
• 4.2.2 脂滴相关蛋白和脂肪合成相关酶mRNA的表达时序
• 4.2.3 Leptin对猪脂肪细胞脂滴相关蛋白基因转录表达的影响
• 4.2.4 Leptin对猪脂肪细胞脂肪生成相关蛋白基因转录的影响
• 4.2.5 Leptin对PPARγ和LXR αmRNA转录表达的影响
• 4.2.6 八眉猪和长白猪脂滴相关蛋白和脂肪生成相关酶mRNA表达差异
• 4.3 讨论
• 第五章 Leptin调控大鼠脂肪细胞perilipin,TIP47,ADRP mRNA表达的分子机理
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 试验动物
• 5.1.2 试验仪器及器械
• 5.1.3 主要试剂及配方
• 5.1.4 试验方法
• 5.1.5 凝胶电泳及凝胶成像和定量分析
• 5.1.6 统计分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 Leptin通过JAK-STAT3通路perilipin、ADRP和TIP47 mRNA的调控作用
• 5.2.2 Leptin通过MEK通路对perilipin、ADRP和TIP47 mRNA表达
• 5.2.3 罗格列酮逆转Leptin对perilipin、ADRP和TIP47 mRNA表达的抑制作用
• 5.2.4 PPAR γ抑制剂逆转Leptin对perilipin、ADRP和TIP47 mRNA表达的抑制作用
• 5.3 讨论
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介