水稻miR156基因克隆及其功能初步分析

论文摘要

miRNA（microRNA）是一类能够调控基因表达却不编码蛋白质、长度约21nt的小RNA。它通过与靶基因RNA分子互补配对来识别并指导靶基因的切割或抑制靶基因的翻译,从而调节真核生物生长发育。miRl56是一个十分保守的植物miRNA,水稻中有12个成员（miR156a-1）,分布在水稻第1、2、4、5、6、8和9条染色体上。为了探索miR156在水稻病毒致病和水稻生长发育过程中的功能,本研究首先克隆了水稻miR156基因,并采用pCAMBIA1300载体质粒,构建miR156的超表达载体；同时采用over-lapping PCR技术,以水稻基因组中IPS1基因序列为骨架,构建了抑制miRl56功能的植物转化载体,然后通过农杆菌介导法遗传转化水稻愈伤组织,并获得转基因水稻植株。分子鉴定显示所转外源目的基因已稳定地整合到转基因水稻染色体中并在转基因植株中高水平表达。与对照相比,过量表达miR156的转基因植株在T0代即表现出植株明显矮缩,分蘖增加,开花延迟,结实率极低或不结实等表型。过量表达miRl56的转基因水稻种子小,内颖有较长的芒,且脊线处无颖毛,发芽较慢,芽的生长很慢等异常性状。通过半薄切片观察发现过量表达miRl 56b水稻植株整体发育程度低于对照植株。通过qRT-PCR分析发现,在过量表达miR156b的转基因水稻植株中,miR156b的靶基因SPL （squamosa promoter-binding-like）家族成员的表达量受到不同程度的影响,同时水稻体内其它一些miRNA的表达量也受到影响,譬如miR164和miRl72的表达量下调。这些研究为深入分析水稻miR156在水稻生长发育过程和水稻病毒致病过程中的功能打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写说明
• 目录
• 第1章 文献综述
• 引言
• 1.1 miRNAs生物发生过程与作用机制
• 1.2 miRNA的功能
• 1.3 与植物生长发育相关的miRNA
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第2章 水稻miR156基因克隆与超表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 仪器设备和试剂
• 2.1.2.1 主要仪器
• 2.1.2.2 主要试剂
• 2.1.3 试验方法
• 2.1.3.1 水稻基因组提取
• 2.1.3.1.1 大量提取
• 2.1.3.1.2 少量提取
• 2.1.3.2 引物设计
• 2.1.3.3 PCR
• 2.1.3.4 DNA片断切胶纯化
• 2.1.3.5 双酶切反应
• 2.1.3.6 连接反应
• 2法）'>2.1.3.7 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.1.3.8 转化和筛选
• 2.1.3.9 质粒提纯
• 2.1.3.10 测序和序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 Os-miR156引物设计
• 2.2.2 Os-miR156基因克隆
• 2.2.3 水稻IPS1（Os-IPS1）基因的克隆
• 2.2.4 抑制Os-miR156功能的载体构建
• 2.3 讨论
• 第3章 水稻miR156表达载体的遗传转化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 水稻品种和农杆菌菌株
• 3.1.2 仪器设备和试剂
• 3.1.3 农杆菌感受态细胞制备
• 3.1.4 农杆菌电激转化
• 3.1.5 重组转化子的PCR鉴定
• 3.1.6 农杆菌的培养
• 3.1.7 幼胚愈伤组织诱导培养
• 3.1.8 成熟胚愈伤组织诱导培养
• 3.1.9 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
• 3.1.10 抗性愈伤组织筛选
• 3.1.11 抗性愈伤组织分化
• 3.1.12 生根、壮苗及移栽
• 3.1.13 水稻基因组DNA的提取
• 3.1.14 转基因水稻植株的PCR鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 农杆菌转化
• 3.2.2 愈伤组织的诱导和培养
• 3.2.3 农杆菌介导遗传转化水稻条件优化
• 3.2.4 抗性愈伤组织的筛选
• 3.2.5 抗性愈伤组织的植株分化与生根
• 0代转基因水稻植株的PCR检测'>3.2.6 T₀代转基因水稻植株的PCR检测
• 3.3 讨论
• 第4章 转基因水稻性状分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 仪器设备和试剂
• 4.1.3 实验方法
• 4.1.3.1 生长发育的表型性状分析
• 4.1.3.2 半薄切片观察
• 4.1.3.3 水稻sRNA提取
• 4.1.3.4 水稻总RNA提取
• 4.1.3.5 qPCR
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 Os-miR156的过量表达以及对其它miRNA的影响
• 4.2.2 过量表达Os-miR156对靶基因SPL家族成员的影响
• 4.2.3 转基因植株表型分析
• 4.2.4 显微结构比较
• 4.3 讨论
• 第5章 结论和进一步研究建议
• 5.1 结论
• 5.2 进一步的研究建议
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢