氧化应激在持续性肺纤维化中作用的实验研究

论文摘要

[研究背景]特发性肺纤维化是一种慢性、进行性恶化的肺间质疾病,以成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖,成纤维细胞灶的形成和细胞外基质的过度沉积为主要病理特征,其发病机制至今尚不完全明确。目前,本病除肺移植术外,尚无其它有效的治疗方法。肺的解剖结构及生理功能决定了肺是最易受到氧化应激攻击的靶器官之一,而近年来的大量研究发现,氧化应激在肺纤维化的形成和发展中发挥着重要作用。细胞外超氧化物歧化酶（ECSOD）是肺组织中主要的抗氧化物,可通过清除多余的超氧阴离子恢复机体内的氧化/抗氧化体系平衡,其在抵抗氧化应激诱导的肺组织损伤方面起着极为重要的作用。近年来的多个研究显示ECSOD对博莱霉素及放射线诱导实验性肺纤维化具有明显的防治作用。然而,目前还没有关于转化生长因子-β1 （TGF-β1）对肺纤维化中氧化/抗氧化体系平衡的失调的影响和ECSOD在TGF-β1诱导的肺纤维化中作用的相关报道。姜黄素是从我国常用中.药姜黄中提取的一种黄色酸性酚类物质,也是姜黄发挥药理作用主要活性成分。姜黄素具有抗炎和抗氧化等广泛药理作用,多个研究表明姜黄素具有预防实验性肺损伤和肺纤维化的功效,但至今尚没有对姜黄素是否具有直接抗TGF-β1诱导的肺纤维化作用的效果评价。[目的]探讨肺纤维化中TGF-β1对ECSOD的影响及肺纤维化中氧化/抗氧化体系平衡的失调。揭示ECSOD对TGF-β1激活的影响和ECSOD在TGF-β1诱导的肺纤维化中的生物学作用。评价姜黄素对TGF-β1诱导的肺纤维化的影响。[方法]实验一：使用腺病毒介导的活化TGF-β1无创建立大鼠肺纤维化动物模型后,采用硝基酪氨酸斑点杂交法及硝基酪氨酸免疫组化染色检测大鼠肺中的氧化应激产物水平及肺内分布,采用实时定量聚合酶链反应及ECSOD免疫组化染色检测TGF-β1对大鼠肺组织中ECSOD的影响。采用实时定量聚合酶链反应检测TGF-β1对正常的人肺成纤维细胞、人肺腺癌细胞（A549）和人胚肺成纤维细胞（MRC-5） ECSODmRNA的表达水平实验二：使用ECSOD小干扰RNA （siRNA）转染MRC-5细胞后检测转染效率。在确认转染成功后,使用重组人TGF-β1对MRC-5细胞进行刺激48小时并检测细胞培养液中TGF-β1和胶原的含量并测定MRC-5细胞中肺纤维化相关基因的表达。构建ECSOD腺病毒（AdECSOD）并分别使用western blot和超氧化物歧化酶活性负染色法确认了其感染的A549细胞可过度表达具有生物活性的人类ECSOD蛋白。继而,我们利用腺病毒介导的ECSOD与TGF-β1在大鼠肺中进行同时双重基因转移,并采用硝基酪氨酸斑点杂交法检测大鼠肺中的氧化应激产物,我们还通过大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞计数、测定大鼠支气管肺泡灌洗液上清液及肺组织中的TGF-β1含量、肺组织形态学观察、纤维化程度盲法病理评分、测定肺组织羟脯氨酸的含量、纤维化相关基因的表达及无创测量大鼠肺组织弹性评价ECSOD对TGF-β1所诱导的肺纤维化形成的干预作用。实验三：使用腺病毒介导的活化TGF-β1无创建立大鼠肺纤维化动物模型后,灌胃或腹腔注射姜黄素进行干预,采用肺组织形态学观察、纤维化程度盲法病理评分、测定肺组织羟脯氨酸的含量及无创测量大鼠肺组织弹性评价以上这两种姜黄素的给药方式对TGF-β1所诱导的肺纤维化的干预作用。[结果]实验一：TGF-β1诱导的大鼠肺纤维化模型中的确有氧化应激状态的存在,表现在肺纤维化大鼠肺中氧化应激产物硝基酪氨酸的增加,免疫组化结果还表明在接受TGF-β1刺激后,大鼠的肺泡上皮细胞和肺间质细胞中均出现了氧化应激状态。在TGF-β1诱导的大鼠肺纤维化模型中,ECSODmRNA水平出现显著的下调,且在大鼠肺纤维灶中ECSOD蛋白表达水平极低。我们的离体实验的结果表明TGF-β1可下调肺成纤维细胞中的ECSODmRNA水平,但对A549细胞中ECSODmRNA水平并没有显著影响。实验二:ECSOD siRNA转染在MRC-5细胞中可显著抑制ECSODmRNA的表达。在无TGF-β1刺激的情况下,ECSOD的减少既没有对TGF-β1的基因转录产生显著影响,也没有对肺纤维化相关基因的表达和细胞胶原的分泌产生显著影响。然而,在外界TGF-β1刺激的情况下,ECSOD的基因沉默显著增加MRC-5细胞培养液中激活状态的TGF-β1,促使MRC-5细胞胶原分泌更多胶原,并使纤维化相关基因的表达进一步上调。此外,我们所构建的AdECSOD可过度表达具有生物活性的人类ECSOD蛋白。腺病毒介导的ECSOD基因转移可显著减轻由TGF-β1引起的氧化应激,有效抑制大鼠自体原本无活性TGF-β1的过度激活,最终可明显减轻大鼠肺纤维化的严重程度,减少肺内胶原沉积,改善纤维化所引起肺功能的减退并抑制肺纤维化相关基因的上调。实验三：在大鼠肺中进行TGF-β1基因转移可诱导大鼠形成严重而持续性的肺纤维化,病理观察显示姜黄素灌胃或腹腔注射没有对由TGF-β1基因转移诱导的大鼠肺纤维化产生显著的影响,以上这两种姜黄素的给药方式也没有显著降低肺内胶原沉积或改善纤维化所引起肺功能的减退。[结论]1在TGF-β1诱导的大鼠肺纤维化模型中有氧化应激状态的存在,这种氧化应激状态分布于肺泡上皮细胞和肺间质细胞中。2 TGF-β1可通过下调ECSOD改变氧化／抗氧化体系的平衡状态。3 ECSOD基因沉默并没有对MRC-5细胞中TGF-β1及纤维化相关基因和细胞胶原分泌产生明显的影响。4 MRC-5细胞在外界TGF-β1刺激的情况下,ECSOD的基因沉默可通过显著增加激活状态的TGF-β1而进一步加强TGF-β1的致纤维化作用。5在大鼠肺中使用腺病毒载体过度表达ECSOD可有效清除由外源性TGF-β1所诱导的活性氧类（ROS）的过度产生,从而维持体内氧化/抗氧化体系的平衡状态,显著抑制ROS对内源性无生物活性的TGF-β1的异常激活并最终改善大鼠肺纤维化严重程度。6姜黄素灌胃或腹腔注射均未能显著减轻TGF-β1诱导的肺纤维化。姜黄素在博莱霉索等肺纤维化动物模型中的作用可能与其抗炎作用密切相关,而其作用靶点可能位于TGF-β1信号转导通路的上游。此外,姜黄素产地的差异可能也对其作用产生一定的影响。综上所述,纠正氧化/抗氧化失衡对于实验性大鼠肺纤维化的防治具有重要的意义。研究肺纤维化时氧化应激发生的机制及对抗氧化失衡的调节途径,可以为肺纤维化的预防和治疗提供新的理论依据并开辟一条新的途径。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 第一部分 文献综述
• 综述一 肺纤维化中的氧化应激与抗氧化治疗
• 1 前言
• 2 活性氧类
• 3 抗氧化体系
• 4 氧化还原稳态与氧化应激
• 5 肺纤维化与氧化应激
• 6 小结
• 参考文献
• 综述二 细胞外超氧化物歧化酶
• 1 前言
• 2 ECSOD的结构及分子生物学特征
• 3 ECSOD基因的调控
• 4 ECSOD与肺纤维化
• 5 小结
• 参考文献
• 综述三 姜黄素预防实验性肺损伤和肺纤维化作用的研究进展
• 1 前言
• 2 姜黄素对实验性肺损伤和肺纤维化的预防作用
• 3 姜黄素对实验性肺损伤和肺纤维化预防作用的机制探讨
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 实验一 转化生长因子-β1对细胞外超氧化物歧化酶的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 实验二 细胞外超氧化物歧化酶对转化生长因子-β1诱导的肺纤维化的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 实验三 姜黄素对转化生长因子-β1诱导的肺纤维化的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论与展望
• 创新点
• 致谢
• 个人简历
• 图版