用于肝组织工程三维多孔活性支架的构建研究

论文摘要

目前,肝移植手术依然是根治末期肝衰竭的唯一手段。但是供体器官的短缺,高昂的手术费用以及术后需要长期服用免疫抑制药物这三方面原因限制了肝移植的发展。以细胞治疗为基础的肝脏治疗方案――肝组织工程,以替代肝移植手术为目标展开研究,希望在未来可以构建人工肝组织,替代部分肝功能。随着肝组织工程的发展,人们对细胞培养支架的要求不再局限于生物相容性,而是要求支架具有生物活性,能够最佳的模拟体内环境,包括各种信号分子,细胞外基质,能够促进细胞增殖、分化,从而引导组织再生。本文旨在构建肝细胞特异性的三维仿生活性支架,用于肝细胞培养,模拟体内肝细胞的生长环境,优化体外肝细胞培养系统,提高肝细胞代谢功能,优化生物人工肝支持系统。以壳聚糖,透明质酸为原料,以肝实质细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的配体-半乳糖基团以共价键合修饰透明质酸,合成半乳糖化透明质酸,再通过冷冻干燥法制备了壳聚糖-半乳糖化透明质酸三维多孔支架。通过红外,元素分析,及X射线光电子能谱表征半乳糖基团对透明质酸的修饰,并考察了支架的形态,亲水性和力学性能。通过细胞在材料表面的黏附,支架中的细胞形态及特异性肝功能的表达表征支架对于细胞的相容性。实验结果表明支架中半乳糖化透明质酸的添加改善了支架的亲水性,增加了三维支架的柔韧性,半乳糖基团的引入为肝细胞提供了贴附位点,提高了肝细胞的贴附率,有利于体外培养肝细胞类肝组织结构的形成和分化功能的表达。以壳聚糖-半乳糖化透明质酸支架为基础,通过物理吸附和化学交联方法结合肝素制备壳聚糖-半乳糖化透明质酸-肝素复合支架,并通过红外,扫描电镜,XPS等手段对复合支架进行表征。通过甲苯胺蓝方法检测肝素,确定肝素在支架上的结合及释放情况。复合支架进一步结合表皮细胞生长因子EGF,用ELISA方法检测EGF的控释,构建了以生长因子修饰的可以实现控制释放的复合活性支架。针对生长因子活性不易保持,容易变性,价格昂贵等缺点,我们进行了将表达生长因子的基因质粒及其载体与组织工程支架相结合,从而构建可进行基因转染的活性多糖三维支架的探索。实验中优化了PEI/DNA基因转染的条件,考察了不同条件下PEI/DNA复合物的粒径和表面电势,探索了基因转染在不同性质支架中存在的转染差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 肝脏
• 1.2 生物人工肝
• 1.2.1 研究现状
• 1.2.2 肝细胞来源
• 1.2.3 肝细胞培养
• 1.2.4 细胞外基质材料
• 1.2.5 细胞与基质材料的相互作用
• 1.2.6 细胞培养条件的优化
• 1.3 生长因子及其控制释放体系
• 1.3.1 生长因子的特点和功能
• 1.3.2 生长因子的控制释放体系
• 1.4 基因转染在组织工程中的应用
• 1.4.1 基因传递的途径
• 1.4.2 基因传递的载体
• 1.5 课题提出
• 第二章 壳聚糖-半乳糖化透明质酸三维多孔支架的制备研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验设备
• 2.2.3 半乳糖化透明质酸的合成和性能表征
• 2.2.4 壳聚糖-半乳糖化透明质酸支架的制备
• 2.2.5 三维支架的红外光谱
• 2.2.6 三维支架的X射线光电子能谱分析（XPS）
• 2.2.7 三维支架的扫描电镜观察（SEM）
• 2.2.8 三维支架的孔隙率的测定
• 2.2.9 静态接触角的测定
• 2.2.10 三维支架机械性能的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 半乳糖化透明质酸的合成和表征
• 2.3.2 壳聚糖-半乳糖化透明质酸支架
• 2.3.3 红外光谱
• 2.3.4 X射线光电子能谱分析
• 2.3.5 静态接触角的测定
• 2.3.6 支架的机械性能测定
• 2.4 小结
• 第三章 原代大鼠肝细胞的体外培养研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验设备
• 3.2.3 实验试剂配制
• 3.2.4 原代大鼠肝细胞的分离
• 3.2.5 原代大鼠肝细胞的贴附实验
• 3.2.6 原代大鼠肝细胞在支架中的培养
• 3.2.7 扫描电镜观察细胞在支架中的生长
• 3.2.8 支架切片观察
• 3.2.9 细胞活性测定
• 3.2.10 原代肝细胞的动态培养
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 原代大鼠肝细胞的分离
• 3.3.2 原代大鼠肝细胞在材料上的贴附
• 3.3.3 原代大鼠肝细胞在支架中的培养
• 3.3.4 原代肝细胞活性的测定
• 3.3.5 肝实质细胞与非实质细胞的共同培养
• 3.3.6 原代肝细胞的动态培养
• 3.4 小结
• 第四章 基于壳聚糖-GHA支架的生长因子控制释放体系的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验设备
• 4.2.3 壳聚糖-GHA支架的制备
• 4.2.4 支架肝素化实验
• 4.2.5 肝素复合支架的表征
• 4.2.6 肝素复合支架的肝素释放实验
• 4.2.7 甲苯胺蓝方法检测肝素
• 4.2.8 肝素复合支架结合EGF和EGF的释放实验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 甲苯胺蓝方法检测肝素
• 4.3.2 壳聚糖-GHA支架的肝素化
• 4.3.3 肝素从复合支架上的释放
• 4.3.4 肝素复合支架的表征
• 4.3.5 肝素-EGF复合支架的EGF释放
• 4.4 小结
• 第五章 基于高分子多糖支架的基因转染研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验设备
• 5.2.3 质粒的制备
• 5.2.4 细胞系的培养
• 5.2.5 PEI的细胞毒性实验
• 5.2.6 PEI/DNA转染最佳N/P比的选择实验
• 5.2.7 PEI/DNA转染最佳DNA加入量的选择实验
• 5.2.8 不同类型细胞系间的转染差异
• 5.2.9 二维培养的原代肝实质细胞的转染
• 5.2.10 三维支架中的细胞转染
• 5.2.11 PEI/DNA复合物的Zeta电势和颗粒粒径
• 5.2.12 海藻酸对PEI/DNA转染体系的影响
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 质粒的制备
• 5.3.2 PEI的细胞毒性实验
• 5.3.3 PEI/DNA转染的最佳N/P比
• 5.3.4 PEI/DNA转染的最佳DNA加入量
• 5.3.5 不同细胞系细胞间的转染差异实验
• 5.3.6 大鼠原代肝实质细胞的二维转染
• 5.3.7 三维支架中的细胞转染
• 5.3.8 动态光散射测定PEI/DNA复合物的Zeta电势和粒径
• 5.3.9 海藻酸对PEI/DNA转染体系的影响
• 5.4 小结
• 第六章 全文总结和创新点
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢