论文摘要
实验一真核表达载体pCMV-（Kozak）TFPI的构建及鉴定目的构建并鉴定真核表达载体pCMV-（Kozak）TFPI,为下一步转染静脉血管内皮细胞抗再狭窄研究奠定基础。方法用RT-PCR的方法提取全长人组织因子途径抑制因子（TFPI）基因,引入Kozak序列和亚克隆位点,将（Kozak）TFPI序列连入T载体中测序。然后将（Kozak）TFPI序列亚克隆入pCMV质粒中,酶切鉴定。结果测序获得的全长人TFPI基因序列与GeneBank中该序列完全一致,Kozak序列成功加入。酶切鉴定（Kozak）TFPI序列成功克隆入pCMV中。结论成功构建了pCMV-（Kozak）TFPI真核表达载体。实验二外源TFPI基因mRNA和蛋白在人脐静脉内皮细胞中表达的检测目的检测真核表达载体pCMV-（Kozak）TFPI在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的表达效果,以评价该载体的表达能力。方法将长有HUVEC的4个6孔培养板中24孔平均分为2组,即TFPI转染组和空载体转染组,每组12孔。TFPI转染组在阳离子脂质体介导下,用pCMV-（Kozak）TFPI转染HUVEC,而空载体转染组则以空载体pCMV代替pCMV-（Kozak）TFPI转染HUVEC,其余条件均相同。转染24h后,以RT-PCR、免疫荧光和Western blot法检测HUVEC中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达,并根据免疫荧光结果计算外源TFPI基因的转染率。结果RT-PCR、免疫荧光和Western blot检测到TFPI转染组中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达。外源TFPI基因的转染率为23%。结论真核表达载体pCMV-（Kozak）TFPI在转染的HUVEC中成功的表达出了外源TFPI mRNA和蛋白。实验三人TFPI基因转染对兔移植静脉血栓形成和近期通畅率的影响目的为减少冠状动脉旁路移植术后血栓形成,探讨人TFPI基因转染对兔移植静脉血栓生成的影响。方法将60只日本大耳白兔随机分为3组,每组20只,即TFPI转染组、空载体对照组和空白对照组。建立颈总动脉旁路移植模型,吻合前,TFPI转染组采用阳离子脂质体pCMV-（Kozak）TFPI（400μg）和腔内加压灌注法（30min）转染移植静脉内皮细胞,空载体对照组以空质粒pCMV（400μg）代替pCMV-（Kozak）TFPI,而空白对照组静脉内皮不予干预。术后3d,用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学法检测外源基因在移植静脉中的表达,病理标本、扫描电镜观察移植静脉血栓形成情况。术后30d,血管多普勒观测其通畅率。结果术后3d,TFPI转染组移植静脉中有人TFPI基因mRNA和蛋白表达。TFPI转染组、空载体和空白对照组分别有1条、8条和7条移植静脉发生血栓;术后30d,以上各组分别有0条、5条和5条移植静脉完全闭塞,前者静脉血栓发生率低于后两者（P<0.05）,而静脉通畅率高于后两者（P<0.05）。术后3d,扫描电镜显示两对照组内皮表面有红细胞和血小板黏附、聚集,而TFPI转染组基本正常。结论人TFPI基因干预,减少了兔移植静脉血栓形成,提高了近期通畅率。实验四人TFPI基因转染对兔移植静脉新生内膜的影响目的为减少冠状动脉旁路移植术后移植静脉再狭窄,探讨人TFPI基因转染对兔移植静脉内膜增生的影响。方法将60只日本大耳白兔随机分为3组,每组20只,即TFPI转染组、空载体对照组和空白对照组。建立颈总动脉旁路移植模型,吻合前,TFPI转染组采用阳离子脂质体pCMV-（Kozak）TFPI（400μg）和腔内加压灌注法（30min）转染移植静脉内皮细胞,空载体对照组以空质粒pCMV（400μg）代替pCMV-（Kozak）TFPI,而空白对照组静脉内皮不予干预。术后3d,用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学法检测外源基因在移植静脉中的表达。术后30d,血管多普勒测量移植静脉管腔内径和管壁厚度。组织病理标本测量内膜面积（I）和中膜面积（M）并计算（I/M）。透射电镜观察移植静脉新生内膜的细胞构成。结果术后3d,TFPI转染组移植静脉中有人TFPI基因mRNA和蛋白表达。术后30d,TFPI转染组移植静脉管腔内径为（2.68±0.32）mm,大于空载体对照组（2.41±0.23）mm和空白对照组（2.38±0.21）mm（P<0.05）。TFPI转染组管壁厚度为（1.09±0.11）mm,小于空载体对照组（1.28±0.16）mm和空白对照组（1.34±0.14）mm（P<0.01）。TFPI转染组移植静脉I和I/M分别为（0.62±0.05）mm2及0.51±0.08,均小于两对照组（0.70±0.05）mm2、（0.72±0.04）mm2（P<0.05）和0.58±0.06、0.59±0.08（P<0.05）;M各组差异无统计学意义（1.23±0.11）mm2、（1.22±0.11）mm2和（1.23±0.12）mm2（P>0.05）。透射电镜观察,TFPI转染组静脉内膜多个视野下未发现平滑肌细胞,而其余两组多个视野下发现平滑肌细胞。结论人TFPI基因转染减轻了兔移植静脉内膜增生。
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