当归芍药散抗阿尔茨海默病的物质基础及作用机制研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是一种以进行性认知功能障碍为主要临床特征的慢性退行性中枢神经系统疾病,该病的主要病理损害表现为细胞外β淀粉样蛋白（β-amyloid peptide,Aβ）聚集形成老年斑、细胞内tau蛋白聚集形成神经纤维缠结、神经元和突触的丢失等反应性改变。随着人口老龄化的发展趋势,AD的高发病率日益威胁和影响着人们的生活质量,给家庭和社会带来了沉重的负担。AD的发病机制目前尚未明了,其中Aβ级联反应假说和胆碱能假说,是对AD发病机理重要的诠释。目前临床上所用的治疗AD的药物主要集中在胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体阻滞剂、清除自由基的抗氧化剂、雌激素类药物等方面,上述药物多是临床对症治疗药物,只能在一定程度上缓解AD某些症状,而不能使这些症状得到根本的治疗和逆转,也不能有效的预防AD,更为严重的是上述药物均存在不同程度的毒副作用。对于AD此类疾病,中医药显示出了其独特的优势,近年来对治疗AD的药物研究中,中药复方及单味药逐渐受到国内外学者的重视。当归芍药散（Danggui-Shaoyao-San,DSS）出自张仲景的《金匮要略》,由当归、芍药、白术、川芎、泽泻、茯苓六味中药组成。原方用于妊娠腹痛及妇人杂病“腹中诸疾痛”。但近年来,该方用于预防和治疗老年性痴呆,取得较好疗效,被认为是最适合于治疗AD的古方之一。本实验室的前期研究表明,DSS能够改善D-半乳糖（D-gal）诱导小鼠的学习记忆,且具有一定的抗氧化应激作用;然而,其具体的作用机制尚不明确,且发挥作用的主要物质也不清楚。为了进一步阐明DSS抗AD的物质基础及作用机制,本论文开展以下研究:第一章,基于AD的临床表现,结合采用D-gal诱导的小鼠痴呆模型和东莨菪碱所致的记忆损伤小鼠模型,筛选出改善AD症状的共同有效部位为醇提部位（DE）;对DE部位的药效及机制进行初步确定和评价时发现,对于D-gal诱导的痴呆小鼠模型,DE能够改善其学习和记忆功能,增强抗氧化系统的抗氧化活性,并能调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达;其作用机制与抑制氧化应激诱导引起的细胞凋亡反应有关。第二章,采用乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂体外模型和Aβ1-42诱导的原代神经元损伤模型相结合的方式对DE及其主要化合物（没食子酸、原儿茶酸、芍药苷、阿魏酸、Z-藁本内酯、泽泻醇B、川芎内酯I、香草酸、芍药内酯苷）进行药效筛选,结果显示,DE、芍药苷和Z-藁本内酯既能抑制AChE的活性,又能有效地保护神经元免受Aβ的毒性作用,增强神经细胞的活力。第三章,用Aβ1-42双侧海马内注射AD大鼠模型考察了DE、芍药苷和Z-藁本内酯的疗效和机制。结果表明,DE和芍药苷通过增加神经细胞的抗氧化能力,调节神经生长因子（NGF）相关信号维持胆碱能神经功能,保护细胞,减少细胞的凋亡;Z-藁本内酯可增强神经细胞的抗氧化能力,维持胆碱能神经功能。此外,用Aβ1-42诱导的原代神经元损伤模型考察了DE和芍药苷的作用,结果表明,DE和芍药苷均可以维持神经元的正常形态,减少氧化应激所产生的ROS,减少神经元的凋亡,从而发挥抗Aβ神经毒性的作用;DE和芍药苷还可以增强Aβ（1-42）诱导的原代海马神经元中NGF、TrkA、TIMP-1和CREB的mRNA表达水平,降低MMP-9的mRNA水平,通过NGF的级联反应通路（MMP-9/NGF/CREB）保护神经元。综上所述,DE是DSS治疗AD的主要有效部位,其所含的各成分发挥着“协同作用”。其中,芍药苷和Z-藁本内酯均能有效地发挥抗AD作用,特别是芍药苷与DE的作用机制基本一致,均能有效改善AD鼠的学习记忆能力,增强脑组织的抗氧化能力,调节NGF的级联反应信号维持胆碱能神经功能,保护神经细胞,减少神经细胞的凋亡。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一章 当归芍药散抗阿尔茨海默病有效部位的筛选
• 第一节 DSS不同提取部位对D-gal所致痴呆小鼠的影响
• 1 材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 动物
• 1.3 仪器与设备
• 2 方法
• 2.1 动物分组及给药
• 2.2 行为学检测（跳台和水迷宫实验）
• 2.2.1 跳台实验
• 2.2.2 通道式水迷宫实验
• 2.3 生化指标的测定
• 2.3.1 海马组织匀浆的制备
• 2.3.1.1 海马组织匀浆中GSH含量的测定
• 2.3.1.2 海马组织匀浆中NO含量的测定
• 2.3.1.3 海马组织匀浆中NOS活力的测定
• +-K⁺-ATP酶活力的测定'>2.3.1.4 海马组织匀浆中Na⁺-K⁺-ATP酶活力的测定
• 2.3.1.5 海马组织匀浆中 β-淀粉样蛋白的检测（ELISA）
• 2.3.2 脑组织切片的制备
• 2.3.2.1 TUNEL染色法检测细胞凋亡
• 2.4 数据统计
• 3 结果
• 3.1 DSS不同部位对小鼠在跳台实验中学习和记忆能力的影响
• 3.2 DSS不同部位对小鼠在通道式水迷宫实验中学习和记忆能力的影响
• 3.3 DSS不同部位对海马组织匀浆中GSH和NO含量的影响
• +-K⁺-ATPase活力的影响'>3.4 DSS不同部位对海马组织匀浆中NOS和Na⁺-K⁺-ATPase活力的影响
• 3.5 DSS不同部位对海马组织匀浆中Aβ 含量的影响
• 3.6 DSS不同部位对脑组织中细胞凋亡的影响
• 4 小结
• 第二节 DSS不同提取部位对东莨菪碱所致记忆损伤小鼠的影响
• 1 材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 动物
• 1.3 仪器与设备
• 2 方法
• 2.1 动物分组及给药
• 2.2 行为学检测（跳台和水迷宫实验）
• 2.2.1 跳台实验
• 2.2.2 通道式水迷宫实验
• 2.3 生化指标的测定
• 2.3.1 海马组织匀浆的制备
• 2.3.1.1 海马组织匀浆中ACh E活力的测定
• 2.3.1.2 海马组织匀浆中NO含量和NOS活力的测定
• 2.3.2 脑组织切片的制备
• 2.3.2.1 HE染色及病理学观察
• 2.4 数据统计
• 3 结果
• 3.1 DSS不同部位对小鼠在跳台实验中学习和记忆能力的影响
• 3.2 DSS不同部位对小鼠在通道式水迷宫实验中学习和记忆能力的影响
• 3.3 DSS不同部位对海马匀浆中ACh E活力的影响
• 3.4 DSS不同部位对海马组织匀浆中NOS活力和NO含量的影响
• 3.5 DSS不同部位对脑组织病理变化的影响
• 4 小结
• 第三节 DE对D-gal所致痴呆小鼠的作用
• 1 材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 动物
• 1.3 仪器与设备
• 2 方法
• 2.1 动物分组及给药
• 2.2 行为学检测（跳台和Morris水迷宫实验）
• 2.2.1 跳台实验
• 2.2.2 Morris水迷宫实验
• 2.3 生化指标的测定
• 2.3.1 海马组织匀浆的制备
• 2.3.1.1 海马组织匀浆中SOD活力的测定
• 2.3.1.2 海马组织匀浆中MDA含量的测定
• 2.3.1.3 海马组织匀浆中GSH含量的测定
• 2.3.1.4 海马组织匀浆中CP含量的测定
• 2.3.1.5 海马组织匀浆中NO含量的测定
• 2.3.1.6 海马组织匀浆中NOS活力的测定
• 2.3.2 脑组织切片的制备
• 2.3.2.1 免疫组织化学染色
• 2.3.2.2 TUNEL染色法检测细胞凋亡
• 2.4 数据统计
• 3 结果
• 3.1 DE对小鼠在跳台实验中记忆能力的影响
• 3.2 DE对小鼠在Morris水迷宫实验中学习和记忆能力的影响
• 3.3 DE对海马组织中SOD活力及MDA、CP和GSH含量的的影响
• 3.4 DE对海马组织匀浆中NOS活力和NO含量的影响
• 3.5 DE对海马组织中Bcl-2，Bax和Caspase-3 蛋白的影响
• 3.6 DE对海马组织细胞凋亡的影响
• 4 小结
• 5 讨论
• 参考文献
• 第二章 当归芍药散抗阿尔茨海默病有效组分的筛选
• 第一节 当归芍药散醇提部位成分分析
• 1 材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 2 方法
• 3 结果
• 4 小结
• 第二节 DE及其组分对乙酰胆碱酯酶的抑制作用
• 1 材料与仪器
• 2 方法
• 2.1 试剂配制
• 2.2 样品处理
• 2.3 微孔板测定
• 2.4 数据统计
• 3 结果
• 4 结论
• 1-42诱导的原代神经元损伤的作用'>第三节 DE及其组分对Aβ_1-42诱导的原代神经元损伤的作用
• 1 材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 动物
• 1.3 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 溶液配制
• 2.2 原代海马神经元的培养
• 2.2.1 海马神经元的培养
• 2.2.2 神经元的鉴定
• 2.3 神经元的药物处理
• 2.4 MTT法检测细胞活力
• 2.5 数据统计
• 3 结果
• 3.1 神经元的鉴定
• 1-42造模浓度的确定'>3.2 最佳Aβ_1-42造模浓度的确定
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3 DE及其不同组分对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.1 DE对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.2 芍药苷对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.3 藁本内酯对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.4 芍药内酯苷对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.5 没食子酸对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.6 阿魏酸对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.7 原儿茶酸对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.8 川芎内酯I对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.9 香草酸对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 1-42损伤神经元的作用'>3.3.10 泽泻醇B对Aβ_1-42损伤神经元的作用
• 4 结论
• 5 讨论
• 参考文献
• 第三章 DE及其有效组分抗AD的机制研究
• 1-42双侧海马注射诱发的AD大鼠的作用'>第一节 芍药苷对Aβ_1-42双侧海马注射诱发的AD大鼠的作用
• 1 材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 动物
• 1.3 仪器与设备
• 2 方法
• 2.1 动物模型制备及分组
• 1-42寡聚体聚合物溶液的制备'>2.1.1 Aβ_1-42寡聚体聚合物溶液的制备
• 2.1.2 模型制备
• 2.1.3 分组及给药
• 2.2 行为学检测（Morris水迷宫实验）
• 2.3 生化指标的测定
• 2.3.1 海马组织匀浆的制备
• 2.3.1.1 海马组织匀浆中SOD和CAT活力、MAD含量的测定
• 2.3.1.2 海马组织匀浆中Ch AT活性的测定
• 2.3.1.3 海马组织匀浆中ACh E活性的测定
• 2.3.2 脑组织切片的制备
• 2.3.2.1 免疫组织化学染色
• 2.4 RNA提取和RCR分析
• 2.4.1 海马组织总RNA提取
• 2.4.2 逆转录指标c DNA
• 2.4.3 PCR引物序列
• 2.4.4 PCR基本过程
• 2.4.5 PCR产物分析
• 2.5 数据统计
• 3 结果
• 3.1 Pae对Aβ（1-42）双侧海马内注射诱发的AD大鼠学习记忆能力的影响
• 3.2 Pae对大鼠海马组织中SOD和CAT活力及MDA含量的影响
• 3.3 Pae对大鼠海马组织中Ch AT和ACh E活力的影响
• 3.4 Pae对大鼠海马组织中相关基因的影响
• 3.5 Pae对大鼠海马组织中MMP-9、TIMP-1 和NGF蛋白表达的影响
• 4 小结
• 1-42双侧海马注射诱发的AD大鼠的作用'>第二节 DE和Z-藁本内酯对Aβ_1-42双侧海马注射诱发的AD大鼠的作用
• 1 材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 动物
• 1.3 仪器与设备
• 2 方法
• 2.1 动物模型制备及分组
• 2.1.1 Aβ（1-42）寡聚体聚合物溶液的制备
• 2.1.2 模型制备
• 2.1.3 分组及给药
• 2.2 行为学检测（Morris水迷宫实验）
• 2.3 生化指标的测定
• 2.4 RNA提取和RCR分析
• 2.5 数据统计
• 3 结果
• 3.1 DE和Lig对Aβ（1-42）双侧海马内注射的AD大鼠学习记忆能力的影响
• 3.2 DE和Lig对大鼠海马组织中SOD和CAT活力及MDA含量的影响
• 3.3 DE和Lig对大鼠海马组织中Ch AT和ACh E活力的影响
• 3.4 DE和Lig对大鼠海马组织中相关基因的影响
• 4 小结
• 1-42诱导的原代神经元损伤的作用'>第三节 DE和芍药苷对Aβ_1-42诱导的原代神经元损伤的作用
• 1 材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 动物
• 1.3 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 溶液配制
• 2.2 海马神经元细胞的原代培养
• 2.3 MTT法检测细胞活力
• 2.4 LDH的检测
• 2.5 流式细胞仪检测细胞内的ROS
• 2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
• 2.7 RT-PCR检测NGF、Trk A、MMP-9、TIMP-1 及CREB的表达量
• 2.8 数据统计
• 3 结果
• 1-42诱导的原代海马神经元活力降低的影响'>3.1 DE和Pae对Aβ_1-42诱导的原代海马神经元活力降低的影响
• 1-42诱导的原代海马神经元LDH活性的影响'>3.2 DE和Pae对Aβ_1-42诱导的原代海马神经元LDH活性的影响
• 1-42诱导的原代海马神经元ROS含量的影响'>3.3 DE和Pae对Aβ_1-42诱导的原代海马神经元ROS含量的影响
• 1-42诱导的原代海马神经元凋亡情况的影响'>3.4 DE和Pae对Aβ_1-42诱导的原代海马神经元凋亡情况的影响
• 1-42诱导的原代海马神经元NGF、Trk A、MMP-9、TIMP-1 及CREB表达量的影响'>3.5 DE和Pae对Aβ_1-42诱导的原代海马神经元NGF、Trk A、MMP-9、TIMP-1 及CREB表达量的影响
• 4 小结
• 5 讨论
• 参考文献
• 第四章 文献综述
• 参考文献
• 论文总结
• 创新点
• 对论文不足之处和需进一步研究的评述
• 致谢
• 个人简历
• 博士期间发表的论文