水稻幼苗特异应答H2O2的miRNA169b启动子活性研究

论文摘要

过氧化氢（H2O2）是一种双功能分子,在植物体内起双重作用,既是一种毒性分子能导致细胞氧化损伤,又是一种信号分子在信号转导中发挥作用。而长度为2024个核苷酸的microRNA（miRNA）在植物中广泛存在,调控植物生长发育以及应答生物和非生物胁迫等许多重要生物学过程。因此,有理由相信miRNA一定在植物应答H2O2的过程中起着关键作用。本研究以H2O2处理水稻幼苗为实验系统,采用高通量深度测序法分析小RNA文库,成功鉴定出水稻幼苗特异应答H2O2的miRNA,这些miRNA前后表达水平的差异预示着它们会在水稻应答H2O2的过程中发挥重要作用。本研究首次从构建的水稻幼苗对照和H2O2胁迫两个小RNA库中,通过对两个小RNA库中miRNA测序数进行大规模比较分析确定发现有7个miRNA家族的测序数存在显著差异,可能是应答H2O2的miRNA家族,其中一个为osa-miR169。osa-miR169家族包含多个成员,我们主要关注其中测序数最多的成员osa-miR169b。osa-miR169b在H2O2处理小RNA文库中的测序次数（QH2O2）为1794,在对照小RNA文库中的测序次数（Q对照）为1163,测序数据表明osa-miR169b为应答H2O2的miRNA,在H2O2处理条件下表达量上调。为了验证测序数据的可靠性,我们又对水稻miR169b进行了Northern杂交检测。测序结果表明miR169b受到H2O2诱导表达,而杂交结果同样显示miR169b在H2O2处理（特别是0.6和3.0 mM）的水稻幼苗中表达量明显增加。Northern杂交结果和测序数据吻合的很好。因此,两部分的结果强有力证明了miR169b是应答H2O2的miRNA,其表达受到了H2O2的诱导。经过Northern杂交验证的表达变化的miR169b基本可以确定为水稻体内应答H2O2处理的miRNA,对miR169b序列进行基因组定位,选取pre-miR169b起始位点上游1500bp序列作为顺式元件分析靶区,使用软件对其中可能的motif进行预测。我们根据预测的结果构建miR169b启动子驱动的LUC报告基因质粒,通过转基因烟草和基因枪瞬时表达的方法来分析miR169b启动子的活性,从而发现和鉴定对H2O2应答起关键作用的顺式作用元件,该研究将有助于发现植物中应答氧化胁迫的关键元件,揭示miRNA基因自身的调控机理,以及在转录水平的分子机制。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述
• 1.1 植物miRNA 研究进展
• 1.1.1 miRNA 的发现
• 1.1.2 植物miRNA 的形成过程
• 1.1.3 植物miRNA 的作用机制
• 1.1.4 植物miRNA 的生理功能
• 2O₂ 在植物中的双重作用'>1.2 H₂O₂在植物中的双重作用
• 2O₂的产生和清除'>1.2.1 H₂O₂的产生和清除
• 2O₂的双重作用'>1.2.2 H₂O₂的双重作用
• 2O₂的危害'>1.2.2.1 H₂O₂的危害
• 2O₂作为信号分子发挥积极作用'>1.2.2.2 H₂O₂作为信号分子发挥积极作用
• 1.3 植物启动子的基本结构及分类
• 1.3.1 组成型启动子
• 1.3.2 组织特异型启动子
• 1.3.3 诱导表达启动子
• 1.3.3.1 生物胁迫诱导型启动子
• 1.3.3.2 非生物胁迫诱导型启动子
• 2. 引言
• 2.1 研究目的与意义
• 2.2 研究思路及其内容
• 3. 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.2 主要载体和试剂
• 3.2.1 质粒与宿主菌
• 3.2.2 试剂与试剂盒
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 RNA 提取
• 3.3.2 miRNA 差异文库构建
• 3.3.2.1 测序数据分析
• 3.3.3 Northern 杂交
• 3.3.3.1 低分子量 RNA 的富集
• 3.3.3.2 电泳和转膜
• 3.3.3.3 探针标记
• 3.3.3.4 预杂交和杂交
• 3.3.3.5 洗膜与压片
• 3.3.4 osa-miR169b 启动子序列生物信息学分析
• 3.3.5 水稻幼苗基因组 DNA 的提取
• 3.3.6 osa-miR169b 启动子不同长度序列扩增
• 3.3.7 PCR 产物回收
• 3.3.8 大肠杆菌感受态细胞制备
• 3.3.8.1 感受态细胞制备所用试剂
• 3.3.8.2 制备程序
• 3.3.9 载体克隆与转化
• 3.3.9.1 转化所需试剂
• 3.3.9.2 转化过程
• 3.3.10 阳性克隆筛选及测序
• 3.3.11 表达载体的构建
• 3.3.12 表达载体的鉴定
• 3.3.13 根癌农杆菌感受态细胞制备
• 3.3.14 表达载体转化农杆菌
• 3.3.15 农杆菌转化子的鉴定
• 3.3.16 转化烟草
• 3.3.16.1 烟草无菌苗的准备
• 3.3.16.2 转基因烟苗的获得
• 3.3.17 基因枪的瞬时转化
• 3.3.18 LUC 活性的测定
• 4. 结果与分析
• 4.1 总 RNA 的提取
• 2O₂ 的osa-miR169b 的发现'>4.2 应答 H₂O₂ 的osa-miR169b 的发现
• 4.3 miR169b 的 Northern 杂交验证结果
• 4.4 miR169b 的启动子片段预测及其生物信息学分析
• 4.5 水稻幼苗基因组 DNA 的提取
• 4.6 osa-miR169b 启动子片段的扩增
• 4.7 osa-miR169b 启动子报告载体的酶切鉴定
• 4.8 转化农杆菌的 PCR 鉴定
• 4.9 转基因烟草的获得与分析
• 4.10 瞬时表达法分析miR169b 启动子活性
• 5. 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 参考文献
• Abstract