盐酸吡格列酮对大鼠角膜新生血管及高危角膜移植排斥反应作用的研究

论文摘要

研究背景角膜移植术是成功率最高的同种异体器官移植手术。但在高危角膜移植中,尽管应用大量的免疫抑制剂,排斥反应的发生率仍高达70%。如何更有效的抑制高危植片排斥反应的发生,成为目前临床中急需解决的问题。盐酸吡格列酮（Pioglitazone,PIO）属噻唑烷二酮类药物,在临床上作为一种胰岛素增敏剂已广泛应用于治疗糖尿病。新近的研究发现,其特异性的受体——过氧化物酶增殖体激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPAR-γ）能作用于炎症和免疫反应的各个环节。PIO及其类似物在心脏、肾脏等器官移植、自身免疫性疾病和新生血管增殖性疾病中的作用已经得到广泛证实。但是,对于它在高危角膜移植中的具体作用尚未见报道,深入研究PIO对角膜移植排斥反应的免疫学机制,可以为有效控制免疫排斥反应提供一个新的切入点。IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子。VEGF是关键的促血管活性因子之一,诱导新生血管的形成。本实验通过建立大鼠穿透性高危角膜移植模型,观察眼局部应用PIO的有效性,研究PIO对角膜新生血管化和高危角膜移植排斥反应的影响,及其与细胞因子PPAR-γ、IL-2、VEGF之间的相互关系。为眼部新生血管性疾病及高危角膜移植免疫排斥反应的防治提供新的手段。第一部分高效液相色谱法测定大鼠房水中盐酸吡格列酮的药物浓度目的以高效液相色谱法（High-performance liquid chromatographic,HPLC）检测眼局部使用PIO滴眼液后不同时间点房水中的药物浓度,探索眼局部用药时PIO的角膜渗透性及有效性,为该药在临床中的合理应用提供实验依据。方法将54只SD大鼠（108只眼）,随机分成0.5%、1%、2%浓度PIO滴眼剂组,分别滴入滴眼剂各1滴,于给药后1h,2h,4h,6h,12h,24h六个时间点抽取房水样品。采用Angilent Eclipse XDB-C18色谱柱为固定相,乙腈:磷酸盐缓冲液（PH 6.5;40:60,v/v）为流动相的HPLC法,检测不同时间点上三种浓度PIO滴眼剂的房水药物质量浓度。并采用SPSS11.5统计软件,将C对AUC做线性回归分析。计量资料用（?）±s表示,三组间大鼠眼房水中药物质量浓度差异,采用析因设计资料的方差分析。以α=0.05为检验水准。结果利用HPLC法检测PIO滴眼剂点眼后大鼠眼房水中药物浓度的色谱图显示:PIO峰与流动相峰及房水峰能很好的分离,并无重合峰等干扰峰出现。各个时间点的房水药物质量浓度之间差异有统计学意义（F=57.377,P=0.000）,三种浓度滴眼剂在给药后4h,房水中药物质量浓度均达到峰值;0.5%、1%、2%浓度PIO滴眼剂组间大鼠眼房水中药物质量浓度差异有统计学意义（F=68.477,P=0.000）;从各个时间点看,三组间有显著性差异,且0.5%PIO组与1%、2%PIO两组比较,差异有显著性（P＜0.001）,说明随着给药剂量的增加,房水中药物质量浓度随之增加。1%PIO组与2%PIO组相比较,除1h时差异有显著性外,余时间点均无显著性差异（P＞0.05）,说明当给药剂量增加到一定程度后,房水中药物质量浓度不再增加,趋于稳定。结论1、PIO滴眼剂眼局部使用具有良好的角膜渗透性;2、大鼠眼局部应用PIO滴眼剂后,在给药后4h房水中药物浓度达到峰值;3、眼局部使用1%、2%浓度PIO滴眼剂房水中药物浓度高于0.5%滴眼剂;4、眼局部使用1%、2%浓度PIO滴眼剂房水中药物浓度无显著性差异。第二部分盐酸吡格列酮对大鼠角膜新生血管作用的研究目的探讨眼局部应用PIO对大鼠角膜新生血管（corneal neovascularization,CNV）的抑制作用及其对CNV化大鼠角膜组织中PPAR-γ、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。方法取24只SD大鼠,角膜缝线法制作大鼠CNV模型,将CNV化大鼠随机分为1%PIO治疗组和生理盐水（N.S）处理组,并以正常大鼠做对照。术后每日于裂隙灯显微镜下观察各组CNV的生长情况,并比较术后5d,12d,20d,28dCNV生长面积;各组均于术后12d随机取6只大鼠摘取完整角膜,HE染色后在光镜下观察CNV化角膜病理组织学形态;免疫组织化学方法检测角膜组织中PPAR-γ和VEGF的表达。并用SPSS 11.5统计软件分析,计量资料用（?）±s表示,各时间点PIO治疗组和N.S处理组CNV面积比较用析因设计资料的方差分析;PPAR-γ和VEGF的表达量用单向方差分析（One-Way ANOVA）,组间两两比较当满足方差齐性时用LSD法,不满足方差齐性时用Dunnett T3法。以α=0.05为检验水准。结果①1%PIO滴眼剂治疗组在5d,12d,20d,28d的新生血管面积分别为3.96±3.07mm2,13.06±4.97mm2,24.42±5.92mm2,10.49±3.12mm2,而生理盐水对照组在5d,12d,20d,28d新生血管的面积分别为9.00±2.22mm2,17.25±2.11mm2,31.89±2.54mm2,19.12±3.15mm2,两组相比差异有统计学意义（P＜0.001）。②诱导CNV后第12d,CNV化角膜HE染色观察结果:B组角膜基质层可见大量的新生血管,管腔大,有淋巴细胞及成纤维细胞浸润,炎症反应较重;与之相比,A组基质层新生血管明显减少,炎症反应也较轻。③PPAR-γ在正常组角膜上阳性细胞计数为2.70±2.16,在新生血管化大鼠角膜上阳性细胞计数为13.30±4.71,两组比较有显著性差异（P＜0.05）。④1%PIO滴眼剂治疗组PPAR-γ和VEGF的阳性细胞计数分别为27.40±14.34,14.90±3.67,N.S处理组PPAR-γ和VEGF的阳性细胞计数分别为13.30±4.71,33.70±11.06。与N.S处理比较,PIO治疗组PPAR-γ的表达大幅度上升（P＜0.05）,VEGF的表达则明显降低（P＜0.05）。结论眼局部应用1%PIO滴眼剂能够抑制大鼠CNV,其机制可能与活化PPAR-γ,降低CNV化角膜上VEGF的蛋白表达有关。第三部分盐酸吡格列酮对大鼠高危角膜移植排斥的影响目的对比观察1%PIO滴眼剂与环孢霉素A（CsA）滴眼剂对高危角膜移植排斥反应的抑制作用及其对角膜移植术后CNV化的影响,探讨1%PIO滴眼剂抑制角膜移植排斥反应的可能作用机制。方法取36只SD大鼠,用角膜缝线法诱导大鼠角膜新生血管,以Wistar大鼠为供体建立高危穿透性角膜移植模型。将受体SD大鼠随机分成,1%PIO治疗组、1%CsA治疗组和生理盐水对照组。术后观察角膜植片的混浊、水肿及新生血管化的程度,并进行各项参数的评分,比较各组植片的平均存活时间;定量分析CNV的生长面积,比较各组角膜移植片CNV化程度;各移植组均于术后第10d,随机取6只大鼠的角膜移植片,制作石蜡切片,HE染色后光镜下观察植片的病理组织形态学特征;免疫组化学方法检测PPAR-γ/、IL-2和VEGF的蛋白表达情况。并用SPSS 11.5统计软件分析,计量资料用（?）±s表示,采用One-WayANOVA,组间两两比较当满足方差齐性时用LSD法,不满足方差齐性时用Dunnett T3法。以α=0.05为检验水准。结果①三组植片平均存活时间比较,1%PIO治疗组、CsA治疗组明显高于生理盐水对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;1%PIO治疗组和CsA治疗组比较,植片平均存活时间显著延长,差异有统计学意义（P＜0.05）。②各组角膜植片CNV的定量分析显示,术后第7d,各组间比较未见显著性差异（F=2.749,P=0.096）;术后第12d,各组间有显著性差异（F=15.389,P=0.000）。1%PIO治疗组的CNV生长面积最低,与CsA治疗组和生理盐水对照组比较,均有显著性差异（P＜0.05）,且CsA治疗组和生理盐水对照组比较也有显著性差异（P＜0.05）。③急性排斥期1%PIO治疗组PPAR-γ的表达最为明显,与其它两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;CsA治疗组和生理盐水对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。1%PIO治疗组和CsA组角膜植片上IL-2的表达水平均明显低于生理盐水对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。1%PIO治疗组VEGF的蛋白表达量最少,与CsA治疗组、生理盐水对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;CsA治疗组和生理盐水对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论1%PIO滴眼剂能有效地抑制角膜移植术后新生血管生长,延长大鼠高危角膜植片的存活时间,其效果优于CsA滴眼剂。1%PIO滴眼剂抑制角膜移植排斥反应的可能机制包括激活核转录因子PPAR-γ,抑制IL-2及VEGF的蛋白表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 高效液相色谱法测定大鼠房水中盐酸吡格列酮的药物浓度
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 参考文献
• 第二部分 盐酸吡格列酮对大鼠角膜新生血管作用的研究
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 参考文献
• 第三部分 盐酸吡格列酮对大鼠高危角膜移植排斥的影响
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 参考文献
• 全文结论
• 附图
• 中英文对照缩略词表
• 综述
• 攻读学位期间论文成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明