肿瘤靶向成像及NO测定的双功能小分子荧光探针研究

论文摘要

分子成像技术近年来已成为最有发展潜力的多学科综合的研究领域。新的肿瘤分子标志物的发现是肿瘤成像技术发展的关键。深入研究肿瘤靶向探针不仅有利于肿瘤早期诊断,而且更有助于肿瘤疗效的客观评价及肿瘤治疗策略的优化。近年来研究发现整合素在肿瘤血管新生过程中起着不可缺少的作用。利用RGD环肽和整合素的亲和性而制备的RGD修饰探针在肿瘤血管靶向成像中取得很好效果。一氧化氮（NO）信号分子在肿瘤的发生和迁移过程中同样具有非常重要的作用。我们实验室合成了一种NO荧光探针,可用于NO直接检测和成像[1,2],但是具有肿瘤靶向和NO测定双功能的荧光探针目前还未见任何报道。本论文首先设计并合成了N-{3-（2-苯基咪唑基）-4-羟基苯基}马来酰亚胺（HMPB）,该化合物在常温下和具有巯基反应基团的环状RGD（RGDfC-SH）反应生成具有强荧光性质的探针RGDfC-HMPB。MDA-MB-231细胞整合素受体表达量高于MCF-7细胞,在这两种细胞中进行了RGDfC-HMPB与细胞整合素受体的亲和实验,荧光显微镜观察结果表明该探针与MDA-MB-231细胞结合能力明显高于MCF-7,进一步研究发现RGDfC-HMPB与MDA-MB-231细胞的亲和能力可被RGD竞争性抑制,充分表明该探针通过RGD配体的介导,靶向结合于细胞的整合素受体。此外,在4T1和S180荷瘤小鼠中研究了RGDfC-HMPB探针的体内分布,结果显示在尾静脉注射72h后,RGDfC-HMPB探针在肿瘤组织中荧光强度最大,提示该探针具有很好的肿瘤血管靶向性。我们将RGDfC-HMPB探针与Cu2+反应制备得到铜（Ⅱ）配合物RGDfC-HMPB-Cu,荧光光谱表征结果表明,铜（Ⅱ）配合物荧光萃灭,与NO反应后荧光重新恢复,提示铜（Ⅱ）配合物可被用于NO的检测。细胞实验结果表明铜（Ⅱ）配合物可以直接检测LPS刺激的RAW264.7细胞中产生的NO。最后,通过铜（Ⅱ）配合物在4T1荷瘤小鼠体内分布研究以及肿瘤组织中NO测定研究,表明铜（Ⅱ）配合物既能靶向肿瘤血管,同时又能有效检测肿瘤组织表达的NO。该双功能荧光探针研究为肿瘤成像探针的研发提供了新的思路,有望成为肿瘤早期诊断的有力工具。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 综述部分
• 第一章 分子成像
• 1.1 分子成像概述
• 1.2 分子成像分类
• 1.3 分子成像应用
• 1.3.1 基因治疗及基因治疗中的基因传递和表达成像
• 1.3.2 可用于标记细胞、微生物和转基因动物的成像
• 1.3.3 揭示机体的生理病理改变过程
• 1.3.4 小动物成像研究
• 第二章 荧光分子成像
• 2.1 荧光分子成像技术
• 2.1.1 荧光分子成像机制
• 2.1.2 荧光分子探针
• 2.1.3 荧光分子成像技术
• 2.2 肿瘤组织中的荧光分子成像
• 2.2.1 荧光分子成像与肿瘤诊断
• 2.2.2 荧光分子成像与肿瘤治疗
• 2.2.3 荧光分子成像与肿瘤药物开发
• 2.3 整合素与肿瘤荧光分子成像
• 2.3.1 整合素与肿瘤血管新生
• 2.3.2 整合素的基本结构
• 2.3.3 RGD环肽靶向整合素在肿瘤荧光分子成像中的应用研究
• 第三章 NO与肿瘤
• 3.1 NO介绍
• 3.2 NO的体内合成
• 3.3 NO体内作用机制
• 3.3.1 NO的cGMP途径
• 3.3.2 NO的硝酰化和S-亚硝酰化
• 3.3.3 NO参与细胞凋亡
• 3.4 NO与肿瘤的发生、发展和迁移
• 3.4.1 NO对肿瘤具有双重作用
• 3.4.2 NO与肿瘤血管新生
• 3.4.3 NO与肿瘤转移
• 3.5 NO的检测
• 小结
• 参考文献
• 实验部分
• 第一章 实验仪器和材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 实验材料
• 1.2.1 化学合成材料
• 1.2.2 细胞株培养及实验材料
• 1.2.3 实验动物和肿瘤模型
• 第二章 实验步骤
• 2.1 荧光化合物HMPB的合成
• 2.2 cyclo-RGDfC的合成
• 2.3 cyclo-RGDfC-HMPB和cyclo-RGDfC-HMPB-Cu的制备
• 2.4 NO的制备
• 2.5 RGDfC、HMPB和RGDfC-HMPB的化学表征
• 2.6 HMPB与活性巯基反应性质
• 2.7 荧光光谱测定
• 2.8 细胞整合素受体亲和性实验
• 2.9 检测LPS刺激Raw264.7细胞产生的NO
• 2.10 生物体内分布实验
• 2.10.1 4T1小鼠乳腺癌模型和S180小鼠肉瘤模型的构建
• 2.10.2 探针注射与组织切片的荧光成像
• 2.11 肿瘤中NO检测
• 2.11.1 RGDfC-HMPB-Cu配合物用于检测4T1荷瘤小鼠中各组织NO变化
• 2.11.2 NO检测试剂盒检测4T1荷瘤小鼠肿瘤组织NO变化
• 第三章 实验结果
• 3.1 HMPB的表征
• 3.2 RGDfC、HMPB和RGDfC-HMPB的化学表征
• 3.3 HMPB与活性巯基反应性质
• 3.4 荧光光谱测定
• 3.5 细胞整合素受体亲和性实验
• 3.6 检测LPS刺激Raw264.7细胞产生的NO
• 3.7 生物体内分布实验
• 3.7.1 RGDfC-HMPB在4T1和S180荷瘤小鼠中的生物分布
• 3.7.2 4T1、S180荷瘤小鼠肿瘤切片观察结果
• 3.8 肿瘤中NO检测
• 小结
• 参考文献
• 致谢