论文摘要
研究背景油菜素甾醇（Brassinosteroids, BRs）是一种广泛存在于植物中的类固醇激素,在植物的生长发育过程中起重要作用。经过十几年的研究,BR信号通路中的许多关键元件都已经被发现,BR信号通路也越来越清晰。植物通过位于细胞膜上的类受体蛋白激酶BRI1感知BR信号,当感受到BR信号后,BRI1的负调控蛋白BK11就会从细胞膜上解离,解除对BRI1的抑制,使BR信号向下游传递。现有的研究结果并没有对BRI1和其互作蛋白之间的调控机制作详细的报道,而作为BRI1的负调控子,BKI1与BRI1互作及调控机制也没有相关报道。研究目的探究BKI1是如何与BRI1结合从而发挥负调节作用的生化机制,并且从BKIl的结构预测出发对BKI1进行更深入的研究。材料与方法：材料：BKI1-RNAi, BKI1-YFP,△304-325-BKI1- YFP,304-325-BKI1- YFP转基因植物；各种截短的BKI1-pEXP-AD502酵母表达载体。方法：1.采用qRT-PCR的方法检测内源BKI1在转录水平的表达量；2.通过下胚轴伸长实验对BR信号的输出强弱进行定性分析；3.通过Blast、多序列比对、蛋白质二级结构预测等方法对BKIl进行生物信息学分析,从蛋白质结构上对BKI1进行初步研究；4.使用酵母双杂交实验寻找BKI1和BRI1互作的最小区域并检测该区域是否是唯一的且必须的互作区域；5.转基因烟草瞬时表达用于快速观察BKI1、A304-325-BKI1和304-325-BKI1的亚细胞定位,揭示304-325在维持BKI1构象中的作用。结果以BKI1-RNAi转基因植物为材料,从表型、内源BKI1的mRNA水平和下胚轴长度等方面证明了内源BKI1的减少可以增强BR信号的输出。之后的同源比对发现BKI1 C末端有两个氨基酸保守区域,并且在二级结构预测中发现其中的一个22个氨基酸的保守区域是C末端唯一的α螺旋结构。通过酵母双杂交实验证明该保守区域是BKI1和BRI1互作不可缺少的区域最后通过烟草定位发现这22个保守氨基酸缺失后BKI1的定位发生了改变,由原来的细胞膜和细胞质定位变成了细胞膜、细胞质和细胞核定位。从而确定了BKI1与BRI1互作的最小区域位于304-325,且初步推测该基序在维持BKI1构象中有一定贡献。结论304-325是BKI1 C末端的一段保守区域,同时也是一个α螺旋结构,该基序是BKI1和BRI1互作的最小区域,并且该基序对于维持BKI1的三维构象有一定的贡献。