论文摘要
宫颈癌,是一种妇科常见的恶性肿瘤,严重威胁妇女健康。但是至今为止,宫颈癌发病机制仍不完全清楚。近年,肿瘤微环境的研究引起广泛高度重视,成为肿瘤生物学研究热点。肿瘤局部微环境中的血管生成和免疫细胞对宫颈癌进展发挥着不可或缺的调节作用。TSLP是一种造血细胞因子,参与调节多种生物学过程,如调节先天和获得性免疫反应,此外在过敏性皮肤病、呼吸道疾病、寄生虫感染和调节肠道免疫中具有重要作用。我们课题组前期工作发现人早孕期滋养细胞分泌的TSLP可以以剂量依赖的方式促进滋养细胞的增殖和侵袭力,并诱导母-胎界面Th2免疫优势。母-胎界面滋养细胞具有独特的类似于肿瘤细胞的生物学行为,即高增殖和侵袭能力。因此我们推测宫颈癌细胞可能通过分泌TSLP,以自分泌和旁分泌作用参与营造宫颈癌微环境。阐明TSLP在宫颈癌发生发展中的调节作用将有助于阐明宫颈癌发病机制。本研究在前期工作基础上,探讨宫颈癌细胞是否通过分泌TSLP调节自身生长；进一步阐明宫颈癌细胞分泌的TSLP对癌灶新生血管形成的调节作用,及其对癌灶浸润的嗜酸性粒细胞功能的作用机制。第一部分TSLP对宫颈癌细胞活力的自分泌调节作用目的分析TSLP在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌细胞生长的调节作用。方法收集人宫颈炎和宫颈癌组织,免疫组化分析各组TSLP的表达；ELISA检测宫颈癌细胞株（HeLa和CaSki细胞）不同时间点分泌的TSLP浓度；流式细胞术分析HeLa和CaSki细胞表面TSLP受体的表达水平；MTT法分析不同浓度重组人TSLP对HeLa和CaSki细胞活力的调节作用；流式细胞术研究TSLP对HeLa和CaSki细胞增殖相关分子Ki-67表达的调节作用。结果与宫颈炎相比,宫颈癌组织高表达TSLP；宫颈癌细胞株Caski和Hela细胞均分泌TSLP,并呈现时间依赖性。此外,两种细胞均表达TSLPR, Caski细胞表达TSLPR水平高于Hela细胞；TSLP处理CaSki和HeLa细胞48或72h后,能显著增强其细胞活力；重组人TSLP（rhTSLP）均能促进CaSki和HeLa细胞表达Ki-67；抗人TSLP或TSLPR的中和性抗体下调Ki-67的表达。宫颈癌细胞通过分泌TSLP,以自分泌方式促进Ki-67表达,进而促进自身增殖,有利于肿瘤的生长和进展。结论宫颈癌细胞可表达TSLP,以自分泌方式上调Ki-67表达,进而促进自身增殖,有利于肿瘤的生长和进展。第二部分宫颈癌细胞来源的TSLP在新生血管形成中的调节作用目的解析TSLP对血管内皮细胞的生物学功能的调节机制。方法收集人宫颈炎和宫颈癌组织,经胰酶消化后获得组织细胞悬液,流式细胞术分析各组血管内皮细胞及人脐静脉内皮细胞系（HUVECs）表面TSLPR的表达水平；然后分别用不同浓度人rhTSLP处理]3UVECs,或者加入HeLa或CaSki细胞培养上清,同时加入抗人TSLP或TSLPR中和性抗体,然后应用BrdU增殖实验、Annexin V-FITC/PI双染法和成管实验分别检测各组HUVECs的增殖、凋亡和成管能力；ELISA法检测各组HUVECs分泌的IL-6、IL-8和VEGF水平；流式细胞术分析HUVECs细胞活化相关分子的表达水平。结果宫颈癌组织中,TSLP（+）的血管内皮细胞比例为20.12%,明显高于宫颈炎组织中的比例5.37%；重组人TSLP处理72h后,可刺激HUVECs增殖。阻断TSLP或TSLPR可显著抑制HeLa和CaSki细胞培养上清对HUVECs细胞增殖的促进效应；rhTSLP上调]HUVECs表达Ki-67,阻断TSLP或TSLPR可显著降低与HeLa或CaSki细胞共培养的HUVECs表达Ki-67;TSLP对HUVECs表面凋亡相关分子（Fas和FasL）的表达无明显调节作用；rhTSLP显著增加CD105的表达,但不改变CD62E的表达；然而阻断TSLP和TSLPR均可降调与HeLa或CaSki细胞共培养后的HUVECs细胞CD105和CD62E的表达水平；rhTSLP增力HUVECs生成IL-6,而阻断TSLP或TSLPR可减少HeLa细胞分泌IL-6、IL-8和VEGF,并下调CaSki细胞分泌IL-6的水平。rhTSLP促进HUVECs细胞血管生成；抗人TSLP中和性抗体抑制HeLa和CaSki细胞诱导的促进HUVECs血管生成作用。结论宫颈癌细胞分泌的TSLP,以旁分泌方式作用于血管内皮细胞,一方面通过上调Ki-67表达促进血管内皮细胞增殖,但不影响其凋亡；另一方面,通过上调CD105和CD62E的表达,活化血管内皮细胞；此外,通过促进宫颈癌细胞和血管内皮细胞分泌IL-6等促血管生成因子,进一步促进新生血管形成。第三部分宫颈癌细胞分泌的TSLP对癌灶内嗜酸性粒细胞功能的调控作用目的探讨TSLP对癌灶嗜酸性粒细胞的生物学功能调节作用。方法收集人宫颈炎、LSIL、HSIL和宫颈癌组织,HE染色分析各组嗜酸性粒细胞的浸润程度。此外临床收集各组外周血嗜酸性粒细胞数量和比例；流式细胞术分析外周血嗜酸性粒细胞表面TSLPR的表达水平；趋化试验分析rhTSLP对外周血嗜酸性粒细胞的趋化作用；随后用rhTSLP处理定向诱导分化嗜酸性粒细胞（HL-60E）,或者建立与宫颈癌细胞株（HeLa和CaSki细胞）的间接共培养体系,ELISA法检测共培养体系中IL-8、FGF、VEGF和GM-CSF的分泌水平；流式细胞术分析与HL-60E增殖、凋亡和功能相关分子的表达水平。结果随着宫颈病变的逐渐进展,病灶部位的嗜酸性粒细胞的浸润增加,二者呈现明显的正相关；但是各组之间外周血嗜酸性粒细胞的数量和比例无明显差异。外周血嗜酸性粒细胞表达TSLP受体；rhTSLP可以以剂量依赖的方式募集外周血嗜酸性粒细胞；CaSki和HeLa细胞均能明显上调HL-60细胞Ki-67、Bcl-2、FasL和Fas的表达；且宫颈癌细胞来源的TSLP可以降调节HL-60细胞Fas的表达,但不参与对HL-60细胞Ki-67、Bcl-2和FasL表达调节；CaSki或HeLa细胞明显促进HL-60细胞HLA-DR、CD80和CD86的表达；但是宫颈癌细胞分泌的TSLP对于HL-60细胞HLA-DR和CD80的表达无调节作用,仅下调HL-60细胞表面CD86表达；经CaSki或HeLa细胞共培养处理后,HL-60细胞表达各种细胞因子的水平均明显增加,且对于IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-5的调节作用可以被rhTSLP、抗TSLP或TSLPR的中和性抗体部分逆转；与宫颈癌细胞CaSki或HeLa细胞进行共培养后FGF的分泌水平无改变；虽然HL-60E细胞本身不分泌IL-8,但是可以明显促进CaSki或HeLa细胞分泌IL-8,且升调节共培养体系中VEGF的分泌,且这一效应可被共培养体系中引入的抗人TSLP或TSLPR的中和性抗体部分抑制。结论宫颈癌灶嗜酸性粒细胞浸润与肿瘤进展呈明显正相关；宫颈癌细胞通过分泌TSLP促进临近组织嗜酸性粒细胞向癌灶趋化的同时,通过刺激IL-5分泌进一步促进癌灶嗜酸性粒细胞祖细胞的分化成熟,并通过下调嗜酸性粒细胞Fas表达,抑制其凋亡,共同导致癌灶嗜酸性粒细胞的大量浸润。TSLP还可以下调嗜酸性粒细胞CD80表达、IFN-γ和TNF-α的分泌,上调IL-10和IL-5的分泌,诱导癌灶局部呈现独特的细胞因子格局,有利于免疫耐受微环境形成。此外,宫颈癌细胞通过分泌TSLP能进一步加强宫颈癌细胞和嗜酸性粒细胞分泌促血管生成因子,有利于宫颈癌进展。综上所述,本研究发现TSLP对宫颈癌进展具有多重调节作用：（1）通过自分泌作用直接上调Ki-67表达,来促进自身增殖生长；（2）通过旁分泌作用血管内皮细胞,促进血管内皮细胞增殖、活化和新生血管形成；（3）通过旁分泌作用招募临近组织嗜酸性粒细胞到达癌灶局部和嗜酸性粒细胞祖细胞分化成熟,进一步抑制嗜酸性粒细胞凋亡,促进嗜酸性粒细胞细胞分泌IL-10和IL-5,抑制其分泌IFN-γ和TNF-α,此外,通过加强宫颈癌细胞和嗜酸性粒细胞之间的相互作用,进而促进微环境中促血管生成因子IL-8和VEGF的分泌,有利于癌灶周围血管生成。本研究为完善肿瘤微环境调控宫颈癌进展机制,及临床治疗嗜酸性粒细胞异常浸润的宫颈癌等提供了新思路。