论文摘要
果皮色泽是柑橘果实的主要外观性状之一,直接影响消费者的视觉,越来越受到人们的关注。柑橘成熟过程中,伴随着叶绿素的降解和类胡萝卜素的积累,果皮颜色由绿色转为橙黄色。部分极早熟品种和自然条件下着色不良的果实,生产上往往利用乙烯进行脱绿处理以加速叶绿素的降解。目前,关于柑橘转色的调控机理仍不十分清楚。滞绿是植物衰老过程中叶绿素不降解或降解缓慢的现象,滞绿突变体是研究叶绿素降解调控的理想材料。青瓯柑是从浙江省温州市的瓯柑中发现的一个果皮滞绿突变体。本研究以青瓯柑和瓯柑为实验材料,分析了果实成熟和采后贮藏过程中PAO(脱镁叶绿素a加氧酶)途径的差异。主要研究结果如下：1.检测了果实不同发育时期青瓯柑和瓯柑中叶绿素及其代谢产物的含量。自转色期开始,瓯柑果皮的叶绿素含量迅速减少,而青瓯柑的叶绿素呈缓慢降解趋势,青瓯柑中总的叶绿素含量显著高于瓯柑,包括叶绿素a、叶绿素b,脱植基叶绿素a、脱镁叶绿酸a,这是青瓯柑成熟和贮藏过程中果皮滞绿的原因。2.分别从青瓯柑和瓯柑中克隆出PAO的同源基因,经过序列比对没有差异。PAO片段全长1798 bp,包含一个1626 bp的开放阅读框,编码了541个氨基酸残基,理论上分子量为60 kDa,等电点为6.41。根据基因库里比对结果显示,PAO氨基酸序列与拟南芥、烟草的相似度分别为75%、85%,与蓖麻、葡萄的相似度均为79%。3.实时荧光定量PCR分析青瓯柑和瓯柑叶绿素降解途径中关键基因的表达情况。结果表明在花后210 d、240 d,瓯柑中PAO、SGR、CAO、NYC1、CLH、PPH的表达量均高于青瓯柑,差异显著,这可能是青瓯柑叶绿素降解缓慢的原因。4. Western杂交检测青瓯柑、瓯柑PAO蛋白在发育及贮藏期的表达量。PAO蛋白表达趋势均是自转色期开始,表达量上升；其中表达量最高的是瓯柑贮藏50 d,表达量最低的是青瓯柑花后170 d。5.分别克隆青瓯柑和瓯柑中PAO基因上游2000 bp的启动子片段,序列比对发现,青瓯柑、瓯柑中均存在4种稍有差异的启动子。主要的差异表现为：一是在ATG上游617 bp处,有长度为9 bp片段(CCTCCGAAA)勺缺失；二是在ATG上游146bp处,有4 bp的重复序列ACAG,有的重复次数为2次,有的为3次；其他差异为单个碱基的差异。6.在线软件预测PAO启动子序列顺式作用元件。结果表明其含有多种作用元件,主要为2类：第一类是植物激素响应的作用元件,第二类是环境信号作用元件。利用甜橙基因组数据,对SGR、CAO、NYC1、CLH、PPH基因上游2000 bp的序列进行上游顺式作用元件分析,结果发现这些基因的启动子序列都有ABA响应元件,除了SGR外,都有低温响应元件。7.实时荧光定量PCR分析与ABA响应元件结合的转录因子ABF家族,与低温响应元件结合的转录因子DREB1/CBF家族的表达,结果显示ABF两个基因及DREB1/CBF两个基因的表达模式与叶绿素降解相关基因表达模式类似。8.实时荧光定量PCR分析乙烯、ABA处理后转色期果实叶绿素降解相关基因和转录因子的表达情况。乙烯处理后,SGR、NYC1、ABF2受乙烯诱导上调明显,处理后48 h基因表达水平最高,且青瓯柑受诱导程度大于瓯柑；ABA处理后,青瓯柑基因表达水平与对照差异不大,其中PAO、ABF4基因表达与对照相比受到抑制。