论文题目: 稻瘟病菌基因表达的表达序列标签和cDNA阵列检测研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物病理学
作者: 金庆超
导师: 李德葆
关键词: 稻瘟病菌,表达序列标签,阵列,检测,发育,信号转导途径,突变体
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 稻瘟病菌[Magnaporthe grisea]引起重要水稻病害。稻瘟病互作系统作为真菌-植物互作分析的模式系统被广泛地研究。目前,研究重点主要集中在稻瘟病菌致病相关发育特别是附着胞的诱导、形成和成熟及其信号传递途径对基因的表达和调控等方面。本文构建了稻瘟病菌的表达序列标签（EST）数据库,并且利用本实验室保存的稻瘟病菌独立克隆制备的cDNA阵列进行了病菌不同发育时期和依赖PMK1的MAPK信号转导途径相关基因缺失突变体中基因表达谱的检测。 1.本文构建了稻瘟病菌菌株Y34菌丝、孢子、疏水表面诱导2h、8h、20h和30h的芽管、幼附着胞、不同成熟附着胞等六个发育时期的cDNA混合文库。从这个文库中获得13057条3’ESTs,拼接出4756个假定独立转录本（TUTs）,包含961个contigs和3795个singletons。在全部拼接出的TUTs中,根据BLASTx搜索结果,2339个TUTs为稻瘟病菌未知基因(E>10-5),剩余的2417个TUTs为功能注释基因,其中36个注释TUTs描述为稻瘟病菌功能蛋白。BLASTn结果显示,菌株Y34有763个TUTs与菌株70-15基因组序列不能匹配(E>10-3),表明稻瘟病菌不同菌株基因间存在较大差异。 2.利用上述稻瘟病菌EST数据库制备了含4108个独立克隆的稻瘟病菌cDNA阵列,用这些cDNA阵列检测病菌上述六个发育时期的基因表达谱,Cyber-T程序共鉴定出511个差异表达基因（P<0.01,倍数变化>2）。定量PCR分析检测了4个差异表达基因和1个无差异表达基因在这6个发育时期的表达丰度,验证了cDNA阵列数据的可靠性。cDNA阵列分析表明,以菌丝或孢子为参比,在稻瘟病菌孢子萌发后的发育过程中,大量基因上调表达,其中主要集中在附着胞成熟时期。仅在菌丝和孢子中差异表达的基因分别有46个和10个,在附着胞的诱导、形成和成熟等发育时期中,剩余差异表达基因主要呈现7种表达谱类型。在病菌不同发育时期,分别鉴定出许多重要的差异表达基因（Magnaporthe CBP1,CYP1,MAGB,PTH11,MPG1和yeast Nif1,protein-tyrosine phosphatase gene etc.）的同源基因。 3.用含4108个稻瘟病菌独立克隆的cDNA阵列检测四个稻瘟病菌PMK1 MAPK途径相关基因MST50、MST11、MST7和PMK1分别缺失的突变体及其野生型菌丝的基因表达谱。以野生型为参比,在突变体mst50、mst11、mst7和pmk1中分别鉴定出86个、60个、151个和264个显著差异表达的基因（P<0.01,倍数变化>2）。定量PCR验证了cDNA
论文目录:
第一章 文献综述
1. 稻瘟病菌
2. 稻瘟病菌侵染相关发育
2.1 分生孢子的吸附和萌发
2.2 附着胞的形成
2.3 侵染栓的形成和侵入
3. 稻瘟病菌的功能基因组研究
3.1 稻瘟病菌的基因组学研究
3.2 稻瘟病菌的表达序列标签研究
3.3 稻瘟病菌基因表达的大规模检测
3.3.1 差异消减展示研究附着胞形成
3.3.2 差减抑制杂交分析附着胞成熟
3.3.3 基因芯片研究菌丝孢子附着胞间基因差异表达
3.3.4 基因表达系列分析研究外源cAMP影响附着胞形成
3.3.5 大规模平行信号测序
3.3.6 cDNA文库测序研究基因表达
4. 稻瘟病菌信号传递途径
4.1 信号识别
4.2 细胞信号传递与调控
4.2.1 cAMP信号传递途径
4.2.2 MAP激酶信号转导途径
4.2.3 Ca~(2+)离子途径
5. 本研究的目的及内容
第二章 稻瘟病菌表达序列标签(EST)研究
1. 材料与方法
1.1 培养基和主要试剂
1.2 菌株和培养方法
1.3 RNA抽提
1.4 cDNA文库的构建
1.4.1 Poly(A+)mRNA的分离
1.4.2 cDNA第一链的合成
1.4.3 cDNA双链的合成和纯化
1.4.4 PCR产物的酶切
1.4.5 酶切 PCR产物(cDNA)的分级和纯化
1.4.6 载体的酶切和纯化
1.4.7 cDNA和载体的连接
1.4.8 连接产物的转化
1.5 cDNA文库的鉴定
1.6 质粒提取
1.6.1 细菌培养
1.6.2 质粒抽提与纯化
1.7 cDNA序列测定
1.8 EST序列的生物信息学分析
1.8.1 EST序列处理的硬件环境和软件信息
1.8.2 EST序列处理的基本流程
1.8.3 TUT的相似性匹配
2 结果与分析
2.1 稻瘟病菌不同发育时期的样品
2.2 RNA提取和cDNA合成
2.3 cDNA文库的质量鉴定
2.4 EST序列生物信息学分析
2.4.1 基本统计分析
2.4.2 稻瘟病菌菌株 Y34与70-15基因表达的比较
2.4.3 功能注释
2.4.4 高丰度表达基因
2.4.5 功能分类
3 讨论
4 小结
第三章 稻瘟病菌基因表达的cDNA阵列检测研究
1 材料与方法
1.1 培养基和主要试剂
1.2 稻瘟病菌材料
1.2.1 六个发育时期的检测
1.2.2 促细胞分裂原信号转导途径相关基因缺失突变体和野生型菌丝的培养
1.3 cDNA阵列探针的准备
1.4 cDNA阵列制备
1.4.1 用于cDNA阵列制备的克隆
1.4.2 cDNA克隆的 PCR扩增与质量控制
1.4.3 PCR产物纯化和点样前处理
1.4.4 cDNA阵列制备
1.5 cDNA阵列杂交和数据提取
1.5.1 预杂交和杂交
1.5.2 洗膜
1.5.3 cDNA阵列杂交数据提取和分析
1.6 实时荧光定量 PCR分析
2 结果与分析
2.1 稻瘟病菌六个发育时期的基因表达研究
2.1.1 杂交信号分析
2.1.2 基于高表达基因的功能分类分析
2.1.3 不同发育时期差异表达基因的鉴定和荧光定量 PCR验证
2.1.4 不同发育时期差异表达基因的变化
2.1.5 差异表达基因的功能分析
2.2 菌丝时期促细胞分裂原信号转导途径的基因表达研究
2.2.1 cDNA阵列数据分析
2.2.2 突变体差异表达基因
2.2.3 物质能量代谢
2.2.4 信号传递和转录因子
2.2.5 突变体生物表型与基因差异表达
2.2.6 差异表达基因的表达谱分析
2.2.7 稻瘟病菌 MAPK途径的相关基因表达模式
3 讨论
3.1 稻瘟病菌cDNA阵列检测基因表达
3.2 稻瘟病菌发育相关基因
3.3 葡萄糖抑制基因
3.4 稻瘟病菌 MAPK信号转导途径
3.5 稻瘟病菌信号途径间相互作用
4 小结
5 附录
本论文所用缩写词及中文对照
参考文献
发布时间: 2006-07-24
参考文献
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