布鲁氏菌减毒活疫苗株adh缺失标记及其鉴别诊断研究

论文摘要

布鲁氏病是布鲁氏杆菌引起的一种在全世界范围内广泛传播的人畜共患病,严重制约着畜牧业的发展。在我国把其定为乙类传染病。根据对宿主的偏好,布鲁氏菌分为六个种,分别为马耳他布鲁氏杆菌Br. melitensis、流产布鲁氏杆菌Br. abortus、猪布鲁氏杆菌Br. suis、绵羊布鲁氏杆菌Br. ovis、沙林鼠布鲁氏杆菌Br. neotomae和犬布鲁氏杆菌Br. cams。目前预防布病最有效的办法就是接种疫苗,现用的疫苗主要包括减毒活疫苗,灭活疫苗和亚单位疫苗等。由于灭活疫苗接种后不能在动物机体内复制,使用接种量比较大,免疫期较短还要加入适当的佐剂和亚单位疫苗生产成本较高等缺点,目前预防布病使用最广泛的还是减活疫苗。市场上用的减毒活疫苗主要包括A19,S2,M5,104M,Rev.1,RB51等。虽然减活疫苗对布病的预防控制取得了很好的效果,但同样存在一些问题,如减活疫苗毒性较强,接种疫苗后的动物患上布病,无法区别是疫苗感染还是野生株感染。针对上述缺点,本论文将减毒活疫苗的adh基因缺失,使其毒力下降,原核表达adh基因成蛋白,用免疫血清学方法鉴别诊断免疫感染和自然感染,具体试验如下：试验1布鲁氏菌减毒活疫苗株adh基因缺失标记本部分试验通过基因芯片和蛋白芯片挑选出毒力相关基因adh,adh是表面抗原基因,从我们实验室中做的蛋白芯片结果来分析,adh蛋白具有诊断抗原性。基于adh基因的这个特性,选择布鲁氏菌常用的减毒活疫苗株S2,M5,A19以adh基因为靶标基因,运用同源重组的原理,用抗性替代的方法成功构建了缺失adh基因的标记疫苗株。在试验中,采取了PCR融合的方法,首先扩增adh基因的N,C端同源臂和卡那基因,并将融合在一起构建成突变盒,其中卡那基因在adh基因N,C端同源臂之间；其次将突变盒连接到pMD19-T Vector（以下简称T载体）构建成突变载体；最后将突变载体电转到减毒活疫苗株的感受态细胞中得到减毒活疫苗株adh基因缺失标记株。试验2布鲁氏菌adh基因缺失标记疫苗株免疫保护性分析本部分试验是将上一步得到的布鲁氏菌adh基因缺失标记疫苗株做保护力评价分析。首先比较标记疫苗株和原始疫苗株在小鼠脾脏内的生存情况：分别用等量的缺失标记疫苗株和原始疫苗株接种免疫Balb/C小鼠,比较两者在小鼠脾脏内的生存能力,在免疫后的1周到5周,每周都从免疫小鼠的脾脏分离细菌,系列稀释后涂板计数,结果显示缺失标记疫苗株能在小鼠脾脏内存活,与原始疫苗株相比,分离出来的缺失标记株少,这表明标记疫苗株的毒力有所下降,但仍能在小鼠体内生存；其次比较标记疫苗株和野生疫苗株对小鼠的保护力：分别用等量的标记疫苗株和原始疫苗株免疫Balb/C小鼠,在免疫后5周攻毒同等量的16M,在攻毒后2周,4周,6周分别从攻毒小鼠的脾脏分离细菌,系列稀释后涂板计数,结果表示标记疫苗株组比原始疫苗株组分离出来的细菌数多,但差异不显著（P>0.05）,可参考在临床上作为疫苗株使用。试验3布鲁氏菌adh基因的蛋白表达纯化本部分试验是通过原核系统将布鲁氏菌adh基因表达成蛋白。由于实验室的前期工作,已经将adh基因载入到了大肠杆菌2566中,所以这部分试验只需要将adh蛋白诱导表达纯化。将构建好的表达载体接到液体培养基LB （Luria bertani medium LB）中,等其生长到对数期,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside IPTG）低温低转速诱导蛋白。待诱导完成后,收集并超声裂解菌体,让其释放出蛋白,将菌体蛋白十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE）,考马斯亮蓝染色确定目的蛋白成功表达。将收集的菌体蛋白重新SDS-PAGE电泳,根据目的蛋白的道尔顿大小切下对应的条带,捣碎加入蛋白浸出液,4℃过夜析出蛋白,测浓度并SDS-PAGE验证。结果表明成功诱导表达纯化了adh蛋白,为下步试验提供了抗原。试验4布鲁氏菌adh基因缺失标记疫苗株与野生株、原始疫苗株的鉴别诊断本部分试验研究主要是通过酶联免疫吸附反应（Enzyme linked immunosorbent assay ELISA）区分缺失标记株和野生株、原始疫苗株。缺失标记疫苗株缺失adh基因,不能表达adh抗原。用缺失标记株免疫小鼠后,不能使小鼠产生adh抗原的抗体。在本试验中,用等量的缺失标记株、原始疫苗株和野生毒株免疫小鼠,在免疫后1周,2周,4周分别给免疫小鼠采血,析出血清。将上一步纯化好的蛋白作为抗原,析出的血清作为抗体进行酶联吸附。结果表明：在免疫后一周,各组中没有很好的区分,可能是由于免疫初期产生的抗体多为IgM；在免疫后第4周,发现原始疫苗株组和野生株组产生的抗体远远高于缺失标记疫苗株组,成显著性差异（P<0.05）。上述结果说明,布鲁氏菌adh缺失标记疫苗株实现了区分野生株和原始疫苗株的目的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语说明
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 布鲁氏菌病原学及布病预防的研究进展
• 1. 布鲁氏菌病的病原学特征及其流行现状
• 2. 布鲁氏菌的致病机理
• 3. 布鲁氏菌病的临床症状、病理变化及诊断
• 4. 布鲁氏菌疫苗的研究进展
• 4.1 减毒活菌苗
• 4.2 灭活疫苗
• 4.3 亚单位疫苗
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第二章 布鲁氏菌减毒活疫苗adh基因缺失标记
• 1. 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒和培养基
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验仪器
• 1.4 试验引物
• 1.5 PCR融合法快速构建突变株载体
• 1.6 布鲁氏菌adh缺失标记株疫苗株的构建
• 2. 结果
• 2.1 目的基因片段的扩增
• 2.2 突变盒的构建验证
• 2.3 突变株的筛选与菌落验证
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 第三章 布鲁氏菌adh基因缺失标记疫苗株免疫保护性分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 菌株、培养基、试剂和器械
• 1.2 试验动物
• 1.3 试验仪器
• 1.4 试验动物的分组
• 1.5 试验菌液的制备
• 1.6 试验小鼠的免疫接种
• 1.7 疫苗株在小鼠脾脏内的清除试验
• 1.8 试验小鼠的攻毒
• 2. 结果
• 2.1 疫苗株在小鼠脾脏体内的清除试验
• 2.2 缺失标记株疫苗与原始疫苗株对小鼠的保护力试验
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 第四章 布鲁氏菌adh基因的蛋白表达与纯化
• 1. 材料与方法
• 1.1 菌株和培养基
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验仪器
• 1.4 目的蛋白adh诱导试验
• 1.5 目的蛋白adh切胶纯化试验
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 第五章 布鲁氏菌adh基因缺失标记疫苗株与野生株、原始疫苗株的鉴别诊断
• 1. 材料与方法
• 1.1 菌株和培养基
• 1.2 试验动物和器具
• 1.3 试验试剂
• 1.4 试验仪器
• 1.5 试验动物领取与分组
• 1.6 试验菌液制备
• 1.7 试验动物小鼠免疫接种
• 1.8 小鼠血清中抗体水平鉴别诊断
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 全文结论
• 创新点
• 致谢