虎纹蛙皮肤分泌物活性肽的分离纯化及表征

论文摘要

生物活性肽是一种自然界广泛存在的对机体有生理作用的活性物质。作为水生到陆生动物间的过渡态生物,两栖动物裸露湿滑的皮肤为了抵御外界有害环境的侵害能分泌大量结构不同、功能各异的生物活性肽。这些生物活性肽的种类、功能和数量与两栖动物的种属及其分布地域有关。目前从两栖动物皮肤分泌物中发现的活性肽具有多种生理功能,如抗菌、抗氧化、抗癌、抗衰老、神经调节、免疫调节等。无尾目两栖动物青蛙和蟾蜍的皮肤分泌物是目前主要的研究对象,从中分离纯化得到的主要为抗菌肽和抗氧化多肽。我国研究者从高原滇蛙中分离得到了一系列由15-30个氨基酸残基组成的抗氧化多肽,并具有很强的抗氧化活性,这种新型的抗氧化系统被命名为“第三套抗氧化系统”。虎纹蛙（Hoplobatrachus rugulosus,又名Rana rugulosa）属于蛙科,虎纹蛙属。在我国分布较广,从东南沿海到西南内陆都有分布,还见于南亚和东南亚一带。到目前为止,研究者只从印度虎纹蛙皮肤分泌物中获得一类抗菌肽,从越南虎纹蛙皮肤中提取得到了一种促胰岛素释放肽,而对于虎纹蛙皮肤分泌物中的抗氧化肽则无报道。本研究以分布于福建省福清市水稻田中的虎纹蛙为实验动物,通过电刺激法提取其皮肤分泌物,利用多种分离纯化手段和活性检测方法对其抗菌和抗氧化活性物质进行了研究,最终从其皮肤分泌物中获得一种抗氧化二肽,对其活性进行了表征,并初步探讨了其抗氧化机理。通过Sephadex G-50凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）对虎纹蛙皮肤分泌物进行了分离纯化,利用纸片扩散法和DPPH自由基清除活力实验分别对其抗菌活性和抗氧化活性进行了追踪检测。研究发现,在分离纯化过程中虎纹蛙皮肤分泌物的抗氧化活性逐步增强,而抑菌活性则减弱,推测其原因可能为其皮肤分泌物中多组分协调发挥抑菌作用,分离纯化过程造成了某些活性组分丢失。最终从中分离得到了一个具有较强抗氧化活性的多肽,通过HPLC-ESI-MS/MS质谱分析,其分子量为277.10 Da,利用MaxEnt3和MasSeq软件分析得到其氨基酸序列为Lys-Met。通过二肽Lys-Met对ABTS·+、DPPH·、·OH和02-·清除力及还原力、金属螯合力实验发现,此二肽具有较好的抗氧化能力。对二肽Lys-Me、Met-Lys及氨基酸Lys、 Met的抗氧化活性进行对比发现,多肽抗氧化活性不但与其氨基酸组成有关,同时也受其序列的影响,并通过液体核磁共振方法对其抗氧化机理进行了初步的探讨。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号及缩略词对照表
• 第一章 引言
• 1.1 两栖动物概述
• 1.1.1 两栖动物分类
• 1.1.2 两栖动物皮肤结构
• 1.2 两栖动物生物活性肽的研究
• 1.2.1 生物活性肽的主要分类
• 1.2.1.1 抗菌肽
• 1.2.1.2 抗氧化肽
• 1.2.1.3 抗癌肽
• 1.2.1.4 神经调节肽
• 1.2.1.5 血管缓激肽
• 1.2.1.6 促胰岛素释放肽
• 1.2.1.7 其他活性肽
• 1.2.2 两栖动物皮肤活性肽的提取
• 1.2.3 皮肤活性肽的分离纯化方法
• 1.2.3.1 凝胶过滤色谱
• 1.2.3.2 离子交换色谱
• 1.2.3.3 反相高效液相色谱
• 1.2.4 多肽序列的鉴定
• 1.2.4.1 Edman降解法
• 1.2.4.2 串联质谱法
• 1.2.5 皮肤活性肽的应用前景
• 1.2.5.1 在食品行业的应用
• 1.2.5.2 在化妆品行业的应用
• 1.2.5.3 在医药行业的应用
• 1.3 本课题的研究内容及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料与仪器设备
• 2.1.1 实验材料与试剂
• 2.1.1.1 实验动物
• 2.1.1.2 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 虎纹蛙皮肤分泌物的收集提取
• 2.2.2 小分子电泳（Tricine-SDS-PAGE）
• 2.2.3 活性肽的分离纯化
• 2.2.3.1 Sephadex G-50凝胶过滤色谱
• 2.2.3.2 反相高效液相色谱（RP-HPLC）
• 2.2.4 活性检测
• 2.2.4.1 抗菌实验
• 2.2.4.2 抗氧化实验
• 2.2.5 质谱分析
• 2.2.6 多肽合成
• 2.2.7 核磁共振氢谱
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 虎纹蛙皮肤分泌物粗提物的分子量分布
• 3.2 虎纹蛙皮肤分泌物抗菌肽的分离
• 3.2.1 粗提物的抑菌活性
• 3.2.2 Sephadex G-50凝胶过滤色谱
• 3.2.3 P1组分反相高效液相色谱图
• 3.3 虎纹蛙皮肤分泌物抗氧化肽的分离及表征
• 3.3.1 凝胶过滤色谱分离抗氧化肽
• 3.3.2 P2组分反相高效液相色谱
• 3.3.3 P25组分反相高效液相色谱分析
• 3.3.4 抗氧化肽的质谱分析
• 3.3.5 抗氧化活性研究
• 3.3.5.1 清除DPPH自由基能力
• 3.3.5.2 清除ABTS自由基能力
• 3.3.5.3 还原力的测定
• 3.3.5.4 清除羟基自由基（.OH）能力
• 3.3.5.5 清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力
• 3.3.5.6 金属螯合力的测定
• 3.4 虎纹蛙抗氧化二肽作用机理的探讨
• 3.4.1 氨基酸种类的影响
• 3.4.2 多肽序列的影响
• 3.4.2.1 清除DPPH自由基能力
• 3.4.2.2 清除ABTS自由基能力
• 3.4.2.3 还原力的测定
• 3.4.2.4 清除羟基自由基（·OH）能力
• 2^-·）能力'>3.4.2.5 清除超氧阴离子自由基（O₂^-·）能力
• 3.4.2.6 金属螯合力的测定
• 3.4.3 核磁共振氢谱研究
• 总结与展望
• 总结
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历