肿瘤坏死因子-α过氧化损伤对人脐静脉内皮细胞形态学影响的研究

论文摘要

目的:分离、培养及鉴定人脐静脉内皮细胞,为动脉硬化的研究提供细胞模型。应用光镜、电镜及原子力显微镜观察正常人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的形态学特征及经肿瘤坏死因子-α（TNF-a）过氧化损伤后的HUVECs的形态学改变;分析电镜及原子力显微镜（AFM）图像,并对AFM及其在观察细胞及细胞膜表面蛋白的方法进行探讨。方法:⑴取健康产妇剖宫产脐带,应用0.1%Ⅰ型胶原酶消化脐静脉的内皮细胞;0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液消化传代;分别应用20%胎牛血清的DMEM培养基、含100mg/ml内皮细胞生长添加物（ECGS）的20%胎牛血清的DMEM培养基及内皮细胞专用培养基（M200+LSGS）培养HUVECs,观察其生长及传代情况;Ⅷ因子免疫细胞化学法鉴定人脐静脉内皮细胞。⑵TNF-a诱导人脐静脉内皮细胞过氧化损伤,用10ng/ml的TNF-a对HUVECs 37℃进行干预24h,同时以未加入任何刺激物的内皮细胞作为正常对照。⑶应用丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）试剂盒测量评价内皮细胞是否发生脂质过氧化损伤及其程度。⑷应用流式细胞仪检测正常及TNF-a诱导后HUVEC膜表面细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达情况。⑸分别应用光镜、扫描电镜及原子力显微镜观察分析正常对照组及TNF-a诱导组HUVECs形态学特点。结果:1 HUVECs分离、培养及鉴定部分:⑴原代培养的内皮细胞在接种后约4h开始贴壁生长,传代细胞1h开始贴壁生长;光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列。⑵Ⅷ因子免疫细胞化学法鉴定可见内皮细胞胞浆中Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。⑶HUVECs在三种培养基中的生长及传代情况:20%胎牛血清的DMEM培养基培养的内皮细胞只能传至2～3代;含100mg/ml ECGS的20%胎牛血清的DMEM培养基的内皮细胞可传至4代;内皮细胞专用培养基（M200+LSGS）的内皮细胞可稳定传至6～7代。2 TNF-a损伤对人脐静脉内皮细胞形态学影响部分:⑴TNF-a可诱导人脐静脉内皮细胞脂质过氧化损伤:对照组内皮细胞脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量为3.35±0.24nmol/ml,TNF-a诱导组MDA含量为5.46±0.11 nmol/ml,与对照组相比显著增加（P<0.01）;对照组内皮细胞合成的一氧化氮（NO）含量为101.33±1.06umol/ml,TNF-a诱导组NO含量为88.02±0.79umol/ml,较对照组NO含量明显减少（P <0.01）。⑵TNF-a可引起人脐静脉内皮细胞膜表面细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达增多:流式细胞仪检测内皮细胞ICAM-1表达发现,正常对照组ICAM-1表达率为52.72±0.20%,TNF-a诱导组ICAM-1表达率为83.33±0.12%,较正常对照组ICAM-1表达明显增多（P <0.01）。⑶HUVECs光镜下可见（×200）:正常对照组内皮细胞呈上皮样贴壁生长,鹅卵石样铺满;内皮细胞呈梭形,细胞核轮廓清晰,核仁可见,胞浆丰富。TNF-a诱导组:内皮细胞排列紊乱,收缩变圆,胞体变小,细胞间隙增大,胞膜边缘不清楚,失去细胞间连接,部分细胞悬浮脱落。⑷HUVECs扫描电镜下可见:正常对照组内皮细胞呈圆球形,表面微绒毛丰富,分布均匀,胞膜完整。TNF-a诱导组:内皮细胞呈出疹样表面,突起数量显著增加,且高低不同,几乎覆盖细胞表面,但微绒毛减少;细胞膜有破损。⑸HUVECs原子力显微镜（AFM）下可见:由于受AFM悬臂伸缩度的限制（<8um）,加上HUVECs为长梭形,纵轴长度接近100um,故很难扫描到内皮细胞完整、清晰的图像。①扫描范围50-70um时大体细胞图像:正常内皮细胞多为长梭形,细胞长轴长度>70um,短轴约25um。细胞核为椭圆形,光滑规则,核长轴约为22.69um,短轴约为16.56um。细胞核隆起,高度约为0.65um。但细胞膜表面结构观察不清。TNF-a诱导组:由于细胞受损后细胞表面起伏较大,未能获得大范围细胞扫描图像。②细胞膜表面1um图像比较正常对照组:细胞膜表面较平滑,如丘陵般蜿蜒,起伏平缓。分析其平均粗糙度为12.32±1.00nm,峰值15.11±0.85。TNF-a诱导组:细胞膜表面紊乱,有许多密集的针芒样突起物,各突起颗粒大小、形状均不相同,隆起与隆起之间似断裂。其平均粗糙度为20.92±0.88nm,峰值25.97±0.96。比较两组细胞膜粗糙度及峰值,TNF-a诱导组较对照组粗糙度明显增加,峰值增大（P <0.01）。结论:1酶消化法成功分离HUVECs,内皮细胞专用培养基体外培养可促进内皮细胞增殖,为动脉硬化的研究提供细胞模型。2 TNF-a可作为诱导剂使血管内皮细胞发生脂质过氧化损伤,超微结构发生改变。3 AFM是一种较好的观察细胞膜表面形态的工具。4 SEM和AFM在观察细胞膜表面形态上各有所长,应联合应用,相互补充。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 肿瘤坏死因子-a 过氧化损伤对人脐静脉内皮细胞形态学影响的研究
• 引言
• 第一部分 人脐静脉内皮细胞的分离、培养和鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 TNF-a 脂质过氧化损伤对人脐静脉内皮细胞形态的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述 原子力显微镜及其在生物学中的应用
• 致谢
• 个人简历