论文摘要
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)是一种从辣根中提取的过氧化物酶(E,C,1.11.1.7),分子量为44000D的糖蛋白,含糖量为18%。它的分子包含一个亚铁血红素辅基,其卟啉环是原卟啉,中心离子是Fe(Ⅱ)。由于原料易得,商品价格低廉,作用底物广泛,成为过氧化物酶中使用最广泛的酶之一。在有机合成中作为催化剂使用,其催化机理为过氧化循环过程,对苯胺及其衍生物,酚类等有很高的催化效率。在酶免疫测定中,由于HRP具有发光底物,因此而建立的化学发光免疫测定在临床中得到广泛应用。近年来,HRP在有机合成、生物传感器、食品分析、生物医学检测、荧光分析、污水处理等方面的应用更为突出。尤其在免疫诊断试剂术、生物传感器、木素降解和工业“三废”处理等方面的应用研究进展飞速。本课题以辣根过氧化物酶为研究对象,以对苯二胺和过氧化氢为底物,在25%的二氧六环溶液中,从酸碱性、温度、底物浓度等几个方面,初步研究了辣根过氧化物酶催化氧化反应的一般特性,测定了部分酶促反应动力学参数,同时对反应产物进行表征。结果发现HRP热稳定性较差,酸碱适应范围较窄,有机相催化效率低,且酶易失活等不良特性。因此,本文以提高有机相酶催化效率、水相酶热稳定性为出发点,结合分子印迹和生物印迹两种技术达到对辣根过氧化物酶的印迹。利用底物对苯二胺诱导酶构象,获得天然印迹酶(NIP),并加入酰化试剂马来酸酐制备乙酰化印迹酶(DIP),冷冻干燥后加入交联剂和引发剂进行紫外光聚合,聚合完毕后用二氧六环洗脱配体,最后干燥就得到了所需的交联印迹酶聚合物(CLIPs),即为水相生物印迹酶。为了考察三种酶(天然印迹酶、乙酰化印迹酶、交联印迹酶聚合物)的性质,研究内容设计如下:(1)考察印迹酶在有机相中的催化活性,并分别考察pH值、温度、水含量、表观Km四因素对印迹酶催化活性的影响。同时与有机相游离酶进行比较;(2)考察乙酰化印迹酶在水相中的催化活性,并分别考察pH值、温度、表观Km三因素对乙酰化印迹酶在水相中的催化活性的影响,同时与水相游离酶进行比较;(3)考察交联印迹酶聚合物在水相中的催化活性,并分别考察pH值、温度、表观Km三因素对交联印迹酶聚合物在水相中的催化活性的影响,同时与水相游离酶进行比较。结果表明,三种酶酸碱稳定范围及最适pH保持不变;印迹后酶活性提高约10倍,表观Km值减小约30倍;交联后酶热稳定性显著提高,80℃时酶活性仍然很高。但催化效率仍然很低。由此可见,生物印迹技术在改良酶特性、提高有机相酶促反应催化效率等方面是行之有效的。但交联印迹酶聚合物催化效率仍然很低,可望从以下几个方面提高未来生物印迹酶催化效率:印迹模板的选择要恰当;最大可能地减小印迹微粒的粒径,以得到可溶的催化剂;酶催化机理研究有待进一步深入。