论文摘要
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，占我国粮食生产和消费的40％，在粮食安全和国民经济中占有举足轻重的作用。由水稻条纹病毒（Rice stripe Virus,RSV）引起的水稻条纹叶枯病是我国粳稻种植区最重要的水稻病毒病害。流行年份，一般田块减产20％～30％，严重田块达80％以上，甚至颗粒无收。近几年，由水稻黑条矮缩病毒（Riceblack streaked dwarf virus,RBSDV）引起的水稻黑条矮缩病再度爆发流行，一般田块发病株率10～30％，严重田块可高达40～80％以上。在田间这两种病毒病常常混合发生、危害巨大。对于病毒病而言，最为经济有效的防治途径是利用品种自身的抗性达到主动控治病害的目的，然而传统的育种获得兼抗两种病毒病、高产、优质品种的难度极大。本研究采用转基因技术，首先构建含两种病毒保守序列的RNA干扰（RNAinterference，RNAi）载体，进而利用农杆菌介导转化水稻成熟胚愈伤组织，通过组织培养获得转基因再生植株，并初步进行了分子检测和抗病性鉴定，主要结果如下：1、分别克隆了Rsv和RBsDv外壳蛋白（coat protein，cP）基因的部分核苷酸片段（Rsv-HcP、RBsDv-Hsl0），并获得二者的串联片段DR。利用RNA干涉载体pMcGl61上的多克隆酶切位点，分别将Rsv-HcP、RBsDv-Hsl0和DR正向、负向插入，从而形成发夹结构，获得的干涉载体分别命名为pMcGl61+／-R、pMcGl61+／-B和pMcGl61+／-D。由于上述干涉载体携带有氯霉素抗性基因，不适合农杆菌介导法的遗传转化，因此再分别将上述3个干涉载体上的发夹结构连接到适合农杆菌介导法转化，且不含潮霉素（hpt）抗性基因的载体pcAMBIAl30-／hpt-上，获得了3个不含抗生素标记基因的RNAi载体，分别命名为pcAMBIAl301+／-R、pcAMBIAl301+／-B和pcAMBIAl301+／-D。2、采用双菌株、双质粒共转化的方法，将携带hpt抗性基因的pcAMBIAl301质粒和不携带hpt抗性基因的pcAMBIAl301+／-R、pcAMBIAl301+／-B和pcAMBIAl301+／-D质粒分别电击转化到农杆菌超毒力菌株EHAl05中，通过遗传转化将两个独立的分别携带目的基因和hpt抗性基因的T-DNA区共整合到水稻模式品种爱知旭的基因组中，目的是既可以在TO代通过抗生素进行抗性愈伤的筛选，又可以通过转基因再生植株后代分离，获得不含标记基因的抗病毒材料。3、在农杆菌EHAl05的介导下，将上述载体分别导入水稻品种爱知旭的成熟胚愈伤组织中，经潮霉素筛选，获得转双价载体pcAMBIAl301+／-D的抗性愈伤组织514个，分化得到447株再生植株；获得转单价载体pcAMBIAl301+／-R的抗性愈伤组织202个，分化得到再生植株139株；转单价载体pcAMBIAl301+／-B的抗性愈伤组织179个，分化得到105株再生植株。4、对256株转双价载体pcAMHIAl301+／-D的T0代植株进行检测时，常规的PcR体系仅检测到46株含目的基因的阳性植株，共转化率为16．8％，与大多数报道的双菌双质粒介导的共转化率相近。应用本研究建立的巢式PcR体系，447株可检测出阳性植株148株，共转化率上升到33．3％，说明在双菌双质粒介导的共转化体系中共转化率可能会因检测体系灵敏度的提高而提高。5、将转基因T0代幼苗移栽到Rsv重发区河南郑州，选择田间自然发病严重的田快，通过自然发病进行了抗病性评价，移栽30～35天后的调查结果表明：转化载体pCDBIAl301+／-D的植株88棵中，其中8株未表现症状（0级），34株表现轻微症状（I级），29株表现中等症状（II级），10株严重症状（III），7株极严重症状（Iv）。但受体发病严重，全部为III或Iv级，发病株率为100％，结果表明：尽管转基因水稻不同株系间存在明显的抗病性差异，但总体来看，转基因水稻T0代植株的长势明显优于非转基因受体植株，可以筛选到高抗Rsv的株系。目前正在江苏省建湖县和姜堰县分别对T2代材料进行抗Rsv和RBSDV的抗病性评价。
论文目录
相关论文文献
标签：水稻条纹病毒论文; 水稻黑条矮缩病毒论文; 双价干涉载体论文; 水稻遗传转化论文; 去除标记基因论文;