论文摘要
新型上皮性钙通道成员的TRPV5/TRPV6表现为对钙离子具有高度选择性,对钙离子代谢及骨代谢有着非常重要的作用。近来研究表明,雌激素、1,25二羟维生素D3、PTH.饮食钙和药物都可调节TRPV5/TRPV6的表达。研究显示,TRPV5主要存在于’肾,TRPV6主要存在于小肠,两者在骨组织主要存在于成骨细胞。目前,国外研究已证明在肾TRPV5、在小肠TRPV6通道通过钙的重吸收作用调节正常细胞内、外的钙水平；已发现大鼠BMSCs来源的成骨细胞诱导分化过程中TRPV5和TRPV6钙离子通道的表达,与颅骨来源的成骨细胞内TRPV5和TRPV6的表达情况一样。但是,针对鸡胚胫骨成骨细胞内TRPV6的表达情况以及与骨质疏松的关系的研究尚未见文献报道。鸡胚胫骨来源的成骨细胞为研究成骨细胞在骨形成中的作用提供了最佳的体外试验模型。采用酶消化和组织块移行生长相结合的方法获取成骨细胞。应用倒置相差显微镜观察、噻唑蓝（MTT）比色法、碱性磷酸酶染色（ALP）、钙化结节染色、姬姆萨染色从形态学、生物学上对细胞进行鉴定。鉴定结果显示,鸡胚胫骨成骨细胞具有典型成骨细胞的形态特征、ALP活性等功能,符合细胞的生长特性,并可在体外发生钙化。本试验取鸡胚胫骨来源的成骨细胞,进行植物雌激素依普拉芬或1,25二羟维生素D3的干预,应用MTT法、RT-PCR以及流式细胞仪技术检测成骨细胞的增殖活性、成骨相关性细胞因子的表达和TRPV6的表达以及细胞内钙离子浓度。结果表明,依普拉芬和1,25二羟维生素D3均可促进鸡胚胫骨成骨细胞的增殖,并且增殖作用明显（P<0.05）,但当浓度分别增大到10-4mol·L-1和10-8mol·L-1时,成骨细胞的增殖开始受到抑制；依普拉芬和1,25二羟维生素D3均可显著地促进细胞内碱性磷酸酶的分泌（P<0.05）,并且ALP mRNA的表达水平与细胞中碱性磷酸酶的分泌呈正相关。RT-PCR检测显示,依普拉芬在10-8mol·L-1时极显著地促进TRPV6mRNA的表达（P<0.01）,在10-10mol·L-1和10-6mol·L-1时出现显著地促进（P<0.05）；而1,25二羟维生素D3在10-10mol·L-1和10-9mol·L-1时极显著地抑制TRPV6mRNA的表达（P<0.01）,并且在浓度降低时出现促进趋势。依普拉芬对PMCAlb mRNA的表达水平出现抑制作用,在10-6mol·L-1时出现极显著地抑制（P<0.01）,10-10mo1·L-1和10-8mol·L-1时出现显著地抑制（P<0.05）；1,25二羟维生素D3对PMCA1b mRNA的表达水平没有规律的变化趋势,但在10-11mol·L-1时出现极显著地促进（P<0.01）,10-12mol·L-1和10－10mo1·L－1时出现极显著地抑制（P<0.01）。依普拉芬在10-8mo1·L-1时极显著地影响细胞内钙离子浓度（P<0.01）,在10-10mol·L-1和10-6mol·L-1时出现显著地促进作用（P<0.05）；1,25二羟维生素D3在10-10mo1·L-1时显著地影响细胞内钙离子浓度（P<0.05）。结果提示,不同浓度的依普拉芬或1,25二羟维生素D3对鸡胚胫骨成骨细胞的增殖、ALP活性具有一定的影响,与TRPV6mRNA、PMCA1b mRNA、 ALP mRNA的表达水平具有相关性,并且对细胞内钙离子浓度也具有影响作用。