魔芋离体形态发生机制及其繁殖技术

论文摘要

魔芋（Konjac）是植物界中迄今发现唯一能大量合成葡苷聚糖（Konjac glucomannan）的高等植物，属天南星科（Araceae）魔芋属（Amrophophallus Blume），为多年生草本植物，广泛分布于我国西南山区，具有悠久的栽培和利用历史。魔芋葡甘聚糖是魔芋地下球茎主要贮藏物质，为一种高分子量碳水化合物，因具有良好的胶溶性、凝胶性、增稠性、成膜性及与其它植物胶的优良复配性等优点而在食品、化工、医药保健、环保等领域具有广泛的应用。因此，魔芋具有极高的市场开发和利用价值。魔芋为单叶柄支撑的单叶植物，通常利用球茎着生的根状茎进行无性繁殖，其繁殖系数极低，且多年沿用无性繁殖造成病原菌的积累、种性的退化，进而导致魔芋产量下降、品质劣化。由于缺乏稳定的良种繁育体系，种芋的数量和质量已经成为魔芋生产发展的瓶颈。自上个世纪80年代以来，许多研究者试图利用组织培养技术生产脱毒试管苗，以繁殖种芋，但试管苗因移栽成活率低且对田间管理技术要求较高，不能实现周年供应和长距离运输等缺点，无法在实际生产中广泛运用。二十世纪90年代以来，随着对植物变态器官发育机理认识的不断深入，人们在试管中已成功诱导出了块茎、球茎、鳞茎等营养繁殖器官，其中马铃薯试管块茎生产体系最为成熟，已经实现了工厂化生产，但有关魔芋试管球茎的研究国内外尚未见报道。本研究以花魔芋（A．rivieri）和白魔芋（A．albus）为材料，对魔芋试管球茎的形成及魔芋组织培养繁殖方式开展了系列研究，主要结果如下：1．幼嫩叶柄是魔芋组织培养较好的外植体，愈伤组织形成率高，状态好。MS+1.0mg／L NAA+1.0mg／L BA适宜于愈伤组织诱导，而MS+0.5 mg／L NAA+0.5 mg／L BA有利于愈伤组织增殖。愈伤组织在继代培养过程中可形成3种不同的类型，即Ⅰ：水渍状，半透明；Ⅱ：淡黄色，结构疏松；Ⅲ：浅红或绿色，呈瘤状或球状，结构致密。在分化培养基上，Ⅰ型愈伤组织不能分化出芽，Ⅱ型可分化出不定芽，而Ⅲ型可通过拟球茎再生完整植株。这三种类型愈伤组织在特定的培养条件下可相互转化。组织学观察显示，三种类型的愈伤组织其组成细胞类型明显不同，其中Ⅲ型愈伤组织由保守分裂型细胞组成，其细胞中含有淀粉和葡甘聚糖颗粒，是一种半组织化结构。中等浓度（1.0～2.0 mg／L）的细胞分裂素（BA、KT、ZT和TDZ）与低浓度（0.1～1.0mg／L）的NAA配合均能促使Ⅲ型愈伤组织再生植株。2．魔芋离体形态建成以器官发生途径为主，拟球茎和芽发生是主要形式。组织学观察显示，魔芋叶柄无维管组织形成层，维管束外层薄壁在培养过程首先启动脱分化，进而形成愈伤组织。魔芋形态建成以器官发生途径为主，在特定培养条件下也可形成体细胞胚，但频率极低，且绝大部分体胚因高度畸形化而不能形成再生植株。魔芋可通过不定芽器官发生途径或拟球茎器官发生途径形成植株，通过拟球茎形成的植株不需生根培养就具有完整的根系，而不定芽在发育过程中不能直接生根且植株生长势弱。不定芽和拟球茎均起源于Ⅲ型愈伤组织的次表皮细胞，这类细胞在分化过程中首先形成拟分生组织团。拟分生组织团在分化培养中既可直接形成芽原基，进而发生不定芽，可形成一种中间的球状体，这种球状体具顶芽分生组织，叶原基不明显，它可进一步发育成拟球茎，进而形成完整植株。3．内源GA3含量增加伴随着不定芽发生，而JA含量增加伴随着拟球茎发生，内源激素平衡是器官发生方式的关键调空因素。魔芋叶柄薄壁细胞在脱分化形成愈伤组织过程中，其内源激素（IAA、GA3、ABA和JA）含量发生了明显的变化。内源IAA含量培养初期缓慢下降，10d后快速上升，30d后达到平稳。内源ABA含量在培养20d内呈下降趋势，之后迅速上升。内源GA3和JA含量则在整个愈伤组织诱导过程中迅速下降。研究发现，三种内源激素（GA3、ABA和JA）在形成芽和拟球茎的愈伤组织中含量变化明显不同。内源GA3水平在拟球茎发生过程中变动不大，而在不定芽发生过程中快速上升，其绝对含量也比前者高；内源ABA在拟球茎发生过程中基本维持稳定，而在不定芽发生过程中则迅速下降；内源JA含量在拟球茎形成过程中呈明显上升趋势，而在不定芽发生过程中变化不明显。只有内源IAA无论是拟球茎还是不定芽形成过程其含量均呈下降趋势。内源GA3与ABA和JA的平衡水平在两种不同器官发生途径中呈现出明显的差异，但GA3／JA差异最为显著，在两种器官发生途径中其变化趋势完全相反。上述结果说明，魔芋离体器官发生形式与内源激素变化及平衡水平相关。4．魔芋试管球茎（即拟球茎）的形成受培养基和培养条件的影响。中等浓度的BA（1.0～2.0 mg／L）与低浓度的NAA（0.1～0.5 mg／L）配合有利于Ⅲ型愈伤组织形成试管球茎，其中以MS+2.0 mg／L BA+0.5 mg／L NAA表现最佳。在一定范围内提高培养基中蔗糖浓度有利于白魔芋试管球茎形成，其中6％（w／v）蔗糖效果最好。而花魔芋试管球茎形成所要求的蔗糖浓度较低（4％）。光周期对试管球茎的发生影响不明显，而培养温度的影响则较大，22℃条件下，花魔芋和白魔芋试管球茎形成率、形成个数和单球茎鲜重均达最大值。试管球茎在培养过程可产生次级小球茎以进行增殖，但自然增殖率较低，通过损伤主芽方法打破主芽顶端优势，可促使次级小球茎的发生。5．选择性培养魔芋愈伤组织有助于降低再生植株遗传变异频率。对魔芋Ⅲ型愈伤组织进行选择并于适宜培养基上继代培养，弃除状态发生改变的愈伤组织类型，获得不同培养时期的4个再生植株群体G0（初代培养产生）、G2（继代3次产生）、G4（继代5次产生）和G7（继代8次产生）。经两种分子标记技术（RAPD和ISSR）分析显示，G0群体变异频率最高（RAPD：15.6％；ISSR：18.0％），G2、G4和G7的变异频率依次下降。四个群体中，G0再生植株的RAPD差异位点数最多，而其它三个群体的植株差异位点数较少。ISSR技术检测的差异位点数比RAPD技术检测到的要高，但在四个群体中分布差异不明显。上述结果表明，通过对Ⅲ型愈伤组织选择性培养不会导致变异频率增加，魔芋组织培养中的不稳定性主要发生于基因组中重复区域，造成植株性状改变的可能性较小。6．试管球茎是建立魔芋繁殖体系的适宜方式，魔芋试管球茎田间生长优势比试管苗明显。将魔芋试管球茎和试管苗进行田间种植，结果发现，试管球茎和试管苗均可用作种芋繁殖。但试管苗只在特定的苗龄期时成活率高，且受移栽时温度影响。试管球茎需要一段时间低温贮藏以完成生理休眠，其植株生长势强，成活率高，体积大的试管球茎（重量大于0.5g）优势更明显。与试管苗相比，由试管球茎产生的球茎体积大、重量高，更适宜于商品种芋的生产。

论文目录

• 目录
• 缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 概述
• 1.2 魔芋种芋生产现状及技术发展趋势
• 1.2.1 魔芋芋种生产中存在的问题
• 1.2.1.1 魔芋繁殖系数低,种芋不足
• 1.2.1.2 种芋农艺性状一致性差,变异及退化严重
• 1.2.1.3 芋种生产技术落后,随种芋贮运传播的病害日趋严重
• 1.2.2 魔芋种芋生产技术发展趋势
• 1.2.2.1 以现代生物技术为依托,生产健康的魔芋基础种
• 1.2.2.2 加强专用型品种选育,整体提升魔芋栽培水平
• 1.2.2.3 建立适宜的供种体系,规范种芋生产
• 1.3 魔芋组织培养研究进展
• 1.3.1 外植体的选取
• 1.3.2 外源激素与愈伤组织诱导及分化
• 1.3.3 魔芋组织培养过程中内源激素的变化
• 1.3.4 魔芋植株再生途径及其组织细胞学研究
• 1.4 组织培养中遗传稳定性研究
• 1.4.1 影响体细胞无性系变异频率的因素
• 1.4.1.1 外植体的类型与生理状态
• 1.4.1.2 培养基及培养方式
• 1.4.1.3 离体培养时间及继代次数
• 1.4.2 体细胞无性系变异的分子遗传学机制
• 1.4.2.1 点突变
• 1.4.2.2 DNA重复序列拷贝数的变异
• 1.4.2.3 转座子活化与DNA甲基化
• 1.4.3 体细胞无性系变异的检测方法
• 1.4.3.1 形态学鉴定
• 1.4.3.2 细胞学鉴定
• 1.4.3.3 生化鉴定
• 1.4.3.4 分子标记鉴定
• 1.4.4 魔芋离体再生植株遗传稳定性研究
• 1.5 本研究的目的和内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验材料的处理与接种
• 2.2.1 试验材料消毒处理
• 2.2.2 培养基及培养条件
• 2.3 组织学制片
• 2.4 内源生长物质的提取及检测
• 2.5 试管苗与试管球茎的田间移栽
• 2.6 植物基因组DNA的提取
• 2.6.1 DNA提取方法
• 2.6.2 DNA浓度和质量检测
• 2.7 数据处理
• 第三章 离体魔芋适宜外植体和培养基的筛选
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料及处理
• 3.2.2 培养基及培养条件
• 3.2.3 愈伤组织诱导、分化及再生植株生根
• 3.2.4 组织细胞学观察
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 愈伤组织诱导与增殖
• 3.3.1.1 外植体类型对愈伤组织诱导的影响
• 3.3.1.2 不同激素组合（NAA、BA）对愈伤组织诱导的影响
• 3.3.1.3 愈伤组织类型及其组织细胞学特征
• 3.3.1.4 不同类型愈伤组织在不同培养条件下的变化
• 3.3.2 愈伤组织分化
• 3.3.2.1 不同类型愈伤组织分化能力比较
• 3.3.2.2 BA与NAA组合对Ⅲ型愈伤组织分化影响
• 3.3.2.3 KT、ZT和TDZ对Ⅲ型愈伤组织分化的影响
• 3.3.3 再生植株生根培养
• 3.4 讨论
• 第四章 魔芋离体形态发生的组织细胞学研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料及处理
• 4.2.2 培养基、培养条件和培养方法
• 4.2.3 组织细胞学观察
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 细胞启动部位与愈伤组织形成
• 4.3.2 不定芽器官发生
• 4.3.3 球茎器官发生
• 4.3.4 体细胞胚发生
• 4.5 讨论
• 第五章 魔芋离体植株形态建成过程内源物质的变化
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.2.2.1 材料接种与培养方法
• 5.2.2.2 培养基及培养条件
• 5.2.2.3 内源生长物质提取及纯化
• 5.2.2.4 内源生活物质的测定
• 5.2.2.5 数据处理
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 愈伤组织形成过程内源激素含量的变化
• 5.3.2 愈伤组织分化培养过程中的两种不同的再生方式
• 5.3.3 拟球茎和不定芽形成过程中内源激素含量的比较
• 5.3.4 内源生长物质间平衡水平的变化及其与器官发生的关系
• 5.4 讨论
• 第六章 魔芋试管球茎形成条件的研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试验材料
• 6.2.2 培养基和培养条件
• 6.2.3 愈伤组织诱导和试管球茎的形成
• 6.2.4 试管球茎的增殖
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 愈伤组织诱导及Ⅲ型愈伤组织的选取
• 6.3.2 试管球茎的形成
• 6.3.2.1 激素组合对试管球茎形成的影响
• 6.3.2.2 蔗糖浓度对试管球茎形成的影响
• 6.3.2.3 光周期对试管球茎形成的影响
• 6.3.2.4 培养温度对试管球茎形成的影响
• 6.3.2.5 培养方法对试管球茎增殖的影响
• 6.4 讨论
• 第七章 魔芋离体再生植株的遗传稳定性研究
• 7.1 前言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 试验材料及处理
• 7.2.2 愈伤组织诱导与植株再生
• 7.2.3 DNA抽提及纯化
• 7.2.4 RAPD和ISSR分析
• 7.2.5 再生植株的移栽
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 愈伤组织诱导、筛选及植株再生与分类
• 7.3.2 RAPD和ISSR引物筛选
• 7.3.3 不同群体间的RAPD和ISSR分析
• 7.3.4 不同群体间差异位点的分布
• 7.4 讨论
• 第八章 魔芋试管球茎和试管苗的生长比较
• 8.1 前言
• 8.2 材料与方法
• 8.2.1 材料
• 8.2.2 试管苗的移栽
• 8.2.3 试管球茎的种植
• 8.3 结果与分析
• 8.3.1 试管苗移栽成活率
• 8.3.2 试管球茎萌发率
• 8.3.3 试管苗与试管球茎所形成的植株之间几个植物学性状比较
• 8.4 讨论
• 第九章 总结与讨论
• 9.1 魔芋愈伤组织类型及其与器官发生能力的关系
• 9.2 试管球茎与不定芽发生的组织细胞学差异
• 9.3 试管球茎与不定芽发生生理生化差异
• 9.4 试管球茎形成条件分析
• 9.5 魔芋再生植株的遗传稳定性分析
• 9.6 魔芋试管球茎的应用前景
• 参考文献
• 附录1 用于分析魔芋再生植株4个群体（G0、G2、G4和G7）的RAPD和ISSR引物序列
• 附录2 魔芋再生植株4个群体（G0、G2、G4和G7）的RAPD扩增带数统计
• 附录3 魔芋再生植株4个群体（G0、G2、G4和G7）的ISSR扩增带数统计
• 附录4 博士在读期间已发表和正在整理的文章
• 致谢