苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5的结构预测及结合特性

论文摘要

嗅觉对于昆虫的生存、繁殖等行为具有重要作用，气味结合蛋白（odorant binding proteins,OBPs）是昆虫嗅觉过程中关键功能蛋白之一。本文克隆、表达并纯化了一个新的苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5，利用荧光竞争结合实验研究了AlinOBP5与盲蝽科性信息素类似物及棉花挥发物的气味结合谱。采用结构生物信息学技术，通过三维结构模拟与分子对接技术预测了该蛋白与配体分子的关键结合位点，然后运用定点突变试验对功能结合位点进行了验证。主要研究结果如下：1.序列分析结果表明AlinOBP5是一个典型OBP，而且隶属于中链OBPs。在进化上该基因与蚊科的OBPs基因具有共同的祖先基因。2.通过原核表达获得了纯化的重组蛋白AlinOBP5。荧光竞争结合实验显示，盲蝽科性信息素类似物不能与其有效结合，而棉花挥发物中的橙花叔醇与AlinOBP5结合能力最强。月桂酸乙酯、β-紫罗兰酮、β-石竹烯、法尼醇和2,3-二甲基苯甲酸与AlinOBP5也有较强的结合力。推测AlinOBP5可能为普通气味结合蛋白，能够选择性地结合某些挥发物并参与其识别过程。3.通过构建3-D结构模型与分子对接模型，我们发现AlinOBP5的结合腔主要有疏水性氨基酸组成，能够与橙花叔醇有特异性的结合。推测三个可能的关键的氨基酸位点分别是Lys74、Met75和Pro121。4.通过定点突变和荧光竞争结合实验证实，Lys74和Pro121在AlinOBP5与配体的识别结合中发挥着重要作用。其中，亲水性的氨基酸残基Lys74可能对初始识别配体以及特异性结合配体发挥作用，而Pro121还可能与配体的释放有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 昆虫气味结合蛋白研究进展
• 1.1.1 气味结合蛋白种类
• 1.1.2 气味结合蛋白功能研究
• 1.1.3 气味结合蛋白的结合特性研究
• 1.1.4 气味结合蛋白结构生物学研究
• 1.2 蛋白 3-D结构建模与分子对接
• 1.2.1 蛋白 3-D结构建模研究进展
• 1.2.2 分子对接
• 1.3 研究思路
• 1.3.1 立题依据
• 1.3.2 研究内容
• 第二章 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5 的生物信息学分析
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与分析
• 2.3 讨论
• 第三章 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5 的克隆、表达和纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试昆虫与试剂
• 3.1.2 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5 的克隆与表达载体构建
• 3.1.3 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5 的诱导表达
• 3.1.4 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5 的纯化
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5 的克隆与表达载体构建
• 3.2.2 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5 诱导表达
• 3.3 讨论
• 第四章 苜蓿盲蝽气味结合蛋白AlinOBP5 的结合特性分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 试剂与仪器
• 4.1.21 -NPN蓝移现象观察
• 4.1.3 荧光竞争结合
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 1-NPN蓝移现象观察
• 4.2.2 荧光竞争结合
• 4.3. 讨论
• 第五章 苜蓿盲蝽AlinOBP5 三维结构建模及结合位点预测
• 5.1 实验方法
• 5.1.1 AlinOBP5 同源建模的模板筛选
• 5.1.2 AlinOBP5 的同源建模
• 5.1.3 AlinOBP5 与配体的分子对接模拟
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 AlinOBP5 的三维结构模型
• 5.2.2 AlinOBP5 与橙花叔醇的分子对接模型
• 5.3 讨论
• 第六章 AlinOBP5 的结合位点突变及结合验证
• 6.1 实验仪器与材料
• 6.1.1 AlinOBP5 突变基因的克隆
• 6.1.2 AlinOBP5 突变体的表达及结合能力测定
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 AlinOBP5 突变基因的克隆
• 6.2.2 突变蛋白的原核表达纯化及结合能力测定
• 6.3 讨论
• 第七章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历