微生物对熊果酸的生物转化及分离研究

论文摘要

熊果酸具有抗致癌、抗促癌和抗血管生成作用,是一种极佳的新型抗癌药物。目前熊果酸衍生物主要采用化学方法合成,与有机合成方法相比,生物转化反应具有很高的立体选择性、区域选择性和化学选择性,反应条件温和,环境污染性小,且有利于提高转化率,降低成本。本论文采用微生物转化技术,利用长柄链格孢菌催化熊果酸底物,建立了转化率的测定方法,优化了熊果酸的微生物转化的条件,分离鉴定出三个单体化合物。主要内容如下：（1）本文建立了发酵液中主要成分的测定方法。用薄层层析法,以环己烷：乙酸乙酯=7：3和氯仿：甲醇=9：1（V/V）作为展开剂,定性地分析底物和产物。建立了高效液相色谱法检测长柄链格孢菌的转化率方法。当液体培养基中底物浓度为0.3mg/mL时,利用RP-HPLC法测定了转化率为42.04%。由于熊果酸紫外吸收较弱,本试验建立的检测方法流动相选择乙腈-水（85：15）,检测波长设为204nm,方法简便快速,熊果酸的进样量在4.0-16.0μg范围内,峰面积与进样量之间线性关系良好。（2）通过对微生物转化条件的优化,由此得出最适摇瓶转化条件为加药量浓度为9mg/mL、转化时间3天、转化温度28℃、摇床转速140r/min、培养基初始pH=5、MgSO4加入量为0.25mg/mL、K2HPO4加入量为1.Og/mL、FeSO4加入量为0.083g/mL在该转化条件下熊果酸转化率为86.20%。（3）使用长柄链格孢AL3.2875对熊果酸进行微生物转化,将转换产物进行分离,利用大孔树脂柱色谱、硅胶柱色谱、反相HPLC柱色谱等手段共分离鉴定出3个转化产物,分别是3-羰基熊果酸、3-0-β-D-吡喃葡萄糖熊果酸苷、28-O-β-D-吡喃葡萄糖熊果酸酯。用MTT法对宫颈癌（Hela）细胞进行体外细胞毒活性测试,转化产物对Hela细胞的抑制活性不明显。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 主要符号表
• 1 前言
• 1.1 生物转化
• 1.1.1 生物转化的定义
• 1.1.2 生物转化的类型
• 1.1.3 微生物转化的特点
• 1.1.4 微生物转化的反应类型
• 1.1.5 微生物转化的影响因素
• 1.1.6 微生物转化的应用
• 1.1.7 微生物转化的意义
• 1.2 熊果酸概述
• 1.2.1 熊果酸简介
• 1.2.2 熊果酸的提取分离和含量测定
• 1.2.3 熊果酸的药理作用
• 1.2.4 熊果酸衍生物的结构修饰
• 1.3 课题研究目的及主要内容
• 1.3.1 本课题研究目的
• 1.3.2 本课题研究的意义
• 1.3.3 论文研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料、仪器及试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 微生物基本培养及转化方法
• 2.2.2 微生物转化的分析方法
• 2.2.3 长柄链格孢菌生长曲线的测定
• 2.2.4 熊果酸转化条件的优化
• 2.2.5 熊果酸转化产物的积累与分离
• 2.2.6 化合物生物活性测试
• 3 结果与讨论
• 3.1 长柄链格孢菌生长曲线的测定结果
• 3.2 菌种筛选的HPLC方法分析
• 3.2.1 高效液相色谱法（HPLC）的建立
• 3.2.2 对有转化作用的3种菌种转化率的测定
• 3.2.3 转化率重复性实验
• 3.2.4 培养基中熊果酸剩余率的测定
• 3.2.5 熊果酸转化率的测定
• 3.3 单因素试验结果
• 3.3.1 转化时间对转化条件的影响
• 3.3.2 底物加入量对转化率的影响结果
• 3.3.3 温度对转化率的影响结果
• 3.3.4 转速对转化率的影响结果
• 3.4 培养基正交试验结果
• 3.5 转化产物的积累及分离制备
• 3.5.1 转化产物的累积
• 3.5.2 转化产物的分离
• 3.6 化合物结构解析
• 3.6.1 化合物1的结构解析
• 3.6.2 化合物2的结构解析
• 3.6.3 化合物3的结构解析
• 3.7 转化产物的活性评价
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢
• 附录