论文摘要
结核病（TB）是当今全球范围对人类最具威胁性的感染性疾病之一，是单病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，全球每年死于结核病的人数接近200万。中国是全球结核病的重灾区，结核病发病总人数居全球第二，每年死于结核病者约25万，结核病夺去的生命多于其它所有传染病所造成死亡例数的总和。耐药结核分枝杆菌的产生和传播及结核合并HIV感染是造成近年来结核病死灰复燃、卷土重来的主要原因。目前对结核病治疗主要使用化学药物，然而由于抗结核药物的不规范治疗，病人体内的结核菌对多种抗结核药物发生耐药，从而形成耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB），这是结核病疫情重新上升的最主要的原因之一。中国结核病疫情的主要特点之一就是耐药率高，耐多药结核病人数居全球第一。因此深入开展结核分枝杆菌耐药机制研究及在此基础上建立适合临床应用的快速耐药检测方法，对于指导结核病临床治疗，控制耐多药结核病的传播，以及开发新型抗结核药物均具有重大的理论意义和实用价值。利福平（rifampin，RFP）和异烟肼（Isoniazid，INH）作为快速全效杀菌剂，是目前最重要的一线抗结核药物，是当今短程抗结核化疗的基础。在结核分枝杆菌耐药机制的研究中占据重要地位。乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）也是重要的一线抗结核药物，具有广谱抗分枝杆菌活性。然而分枝杆菌对EMB产生耐药的分子机制仍不十分清楚，各国学者的研究报道仍存在较多争议，亟待进一步研究。本文应用DNA测序技术分析87株来源于河南省结核病耐药监测项目收集的结核分枝杆菌分离株，其中对RFP、INH、链霉素（streptmycin，SM）和EMB均敏感的35株，具有不同耐药模式的耐药株52例，其中耐RFP 47例，耐INH 49例，耐EMB 28例。对所有菌株的耐药相关基因rpoB、katG、inhA调节区和embB的突变热点区同时进行基因型分析。结果显示47例耐RFP分离株中，43株（91．5％）在利福平耐药性决定区（RRDR，rifampin risistant determination region）出现基因突变。共检出15种错义突变类型，涉及15种氨基酸改变。最常见的突变类型发生在531密码子上，共占全部突变株的58．1％（25／43）。49例耐INH分离株中，36例（73．5％）检出基因突变，且发生在315密码子位点。序列分析覆盖了inhA调节区的DNA序列，共检出4例（8．2％，4／49）在-15碱基位点发生C→T的置换。其中，1例同时伴随katG点突变，另3例不伴随katG点突变。79．6％（39／49）的耐INH分离株至少在katG 315位点或inhA调节区发生一种突变。28例EMB耐药株中，16例（53．4％）在embB 306密码子发生基因突变，突变类型包括M306V（ATG→GTG），M306L（ATG→CTG），M306I（ATG→ATA），M306I（ATG→ATT）和M306I（ATG→ATC）5种类型。其中M306I（ATG→ATC）突变类型为国内首次报道。在24例对EMB敏感而对RFP和INH耐药的菌株中，4例（16．7％）也在306密码子位点检出基因突变。而对RFP、INH、SM和EMB均敏感的35例结核分枝杆菌分离株中，它们的rpoB、katG、inhA调节区和embB基因均未检出相应的突变。对rpoB、katG与embB306位点的突变对比分析。研究结果表明结核分枝杆菌耐RFP主要由rpoB基因突变引起，最常见的突变类型发生在531密码子。耐INH与katG基因和inhA基因调节区突变有关，且katG 315密码子位点突变是主要因素。研究结果也初步揭示embB306位突变可能并不是结核分枝杆菌对EMB产生耐药的直接原因，而可能与耐多药产生相关。本文首次对耐药结核分枝杆菌embB306位点与rpoB基因和katG基因突变的相关性进行了初步分析，结果表明耐药结核分枝杆菌embB306位点突变同时伴随rpoB基因突变为100％（19／19），高于同时伴随katG315位点突变（73．7％，14／19）。为进一步研究结核分枝杆菌耐多药与EMB耐受的分子机制提供了必要的信息。本研究结果为研制和开发耐药结核分枝杆菌快速检测方法奠定了基础。长期以来结核分枝杆菌药敏试验一直是结核病细菌学诊断中至关重要的技术。但传统的结核病药敏检测方法为表型耐药检测方法，其建立在结核分枝杆菌的培养基础之上，通常至少需要4到6周的时间，远不能满足临床治疗的需要。因此基于当前结核病分子生物学的研究进展，本文建立和评价了一种新型的快速进行利福平和异烟肼耐药检测的反向系列探针杂交方法。应用该方法设计了一个放置了18条探针的多重寡核苷酸探针阵列，可以同时检测与FRP和INH耐药相关的rpoB、katG、inhA基因调节区和ahpC基因内间隔区的碱基突变，并同时可对结核分枝杆菌复合群进行鉴别诊断。应用本研究建立的方法检测52株耐多药结核分枝杆菌，46株（88．5％）在rpoB突变热点区检出突变。与rpoB的PCR产物测序结果对比分析，探针阵列上野生型探针检测RFP耐药与测序的结果符合率是98．1％（51／52），突变型探针检测结果的符合率是100％（52／52）。应用本研究建立的方法，86．5％（45／52）的耐INH分离株在katG315位点，或inhA调节区，或ahpC基因内间隔区检测到至少一种突变。选择10例INH耐药和10例INH敏感株，对katG、inhA基因调节区和ahpC基因内间隔区进行测序分析，探针阵列上野生型探针和突变型探针的检测结果均与测序结果一致。应用该方法检测35例敏感株的耐药相关基因，均未检出突变。总体上，与传统的表型耐药检测结果相比，反向系列探针杂交方法检测RFP耐药的敏感性是88．5％（46／52），特异性是100％（35／35）；检测INH耐药的敏感性是86．5％（45／52），特异性是100％（35／35）。反向系列探针杂交方法提供了一次杂交实验即可快速获得结核杆菌对多种药物的耐受信息，使得结核杆菌分离株耐药性检测从常规的4—6周的时间缩短到6—8h，充分显示了常规方法不可比拟的优越性。因此有可能发展成为应用于临床快速耐药检测的新方法，这种反向系列探针杂交方法也可以用于耐多药结核病的流行病学调查和研究，为耐药结核病的控制起到重要作用。目前分枝杆菌的发病率也呈上升趋势，由于非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）对大多数抗结核药物天然耐受，并且NTM的传播途径与结核病的人—人的传播途径不同，因此快速、准确对结核病和非结核分枝杆菌病进行鉴别诊断，并针对性的对患者采取有效的治疗和控制措施非常重要。传统的分枝杆菌菌株鉴定方法经常与药敏检测同步进行，也是建立在分枝杆菌的培养基础之上，费时、费力，且时常不能给出明确的结果，难以满足临床治疗的需要。因而建立结核分枝杆菌快速耐药检测方法的同时，不可回避地需要建立对分枝杆菌同步进行快速菌种鉴定的检测方法。基于反向系列探针杂交技术，本研究选择分枝杆菌16S—23S rRNA基因内转录间隔区（16S—23S rRNA gene internal transcripted spacer）为靶DNA序列，设计一个新型的多重寡核苷酸探针阵列，包括16个属、群和种特异性探针。应用该技术检测126例来自中国河南省结核病耐药监测项目的临床分枝杆菌分离株。其中结核分枝杆菌56株，牛型分枝杆菌8株，非结核分枝杆菌62株。结果显示多重探针阵列中分枝杆菌属特异探针和结核分枝杆菌复合群群特异探针具有100％的特异性和敏感性。80．4％（50／62）的非结核分枝杆菌分离株被直接鉴定到种的水平。通过BLAST和RIDOM对国际上现存的16S—23S rRNA基因内转录间隔区序列进行比对分析，并结合系统进化树分析，发现鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和偶然分枝杆菌的基因内转录间隔区存在多态性。本研究所发现的一些新的分枝杆菌基因内转录间隔区序列型（sequevar）已经在Genbank中登记。反向系列探针技术从分枝杆菌菌株处理到菌种鉴定结果判断仅需6—8个h，与传统所需4—6周的时间相比，显示了巨大优越性。并且通过大量的整合试验，本探针阵列从菌株DNA提取、PCR扩增、分子杂交和酶联显色全套过程可以与结核分枝杆菌耐药检测探针阵列同步进行，成为结核分枝杆菌耐药快速检测的配套技术。随着在Genbank中积累更多的分枝杆菌基因内转录间隔区的序列信息，对设计的探针进一步完善和优化，本研究建立的反向系列探针技术有可能成为临床快速、准确进行分枝杆菌菌种鉴定的新方法。本文在对结核分枝杆菌耐药分子机制进一步研究的基础上，依据本研究建立的寡核苷酸探针阵列核心技术平台，建立了一套可以同步进行结核分枝杆菌RFP、INH耐药基因快速检测和分枝杆菌快速菌种鉴定的反向系列探针杂交技术。本文研究结果这为进一步揭示结核分枝杆菌耐药机制和建立适宜临床应用的快速检测方法奠定了基础。
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