论文摘要
Cystatin是一类与半胱氨酸蛋白酶紧密结合的、可逆的天然抑制剂。因为这些半胱氨酸蛋白酶存在于所有生物体内,并参与多种生物学、病理学过程,所以cystatin对这些蛋白酶的功能调节尤其重要。在免疫系统中,cystatin可调节组织蛋白酶活性和抗原提呈,诱导TNFα和IL-10的合成,并且刺激IFN-γ激活的鼠巨噬细胞产生NO。我们在前期研究中,建立了一个poLyI:C诱导大黄鱼脾脏SmartcDNA文库,从中发现了两个编码不同半胱氨酸蛋白酶抑制剂的EST克隆,经测序比对后确定为大黄鱼stefin和cystatin类似物,同属于cystatin家族。本文首先克隆了1个大黄鱼cystatin全长cDNA。序列分析结果表明,大黄鱼cystatin全长cDNA包括688个核苷酸,编码一个118个氨基酸的蛋白,分子量13kDa,推测其具有一个由21个氨基酸组成的信号肽序列。分别与鱼类、高等脊椎动物和线虫类有27.1-45.9%,30.0-31.7%和16.3-30.6%的序列一致性,其中与pufferfish的序列一致性最高,为45.9%。与人的cystatin C有30.8%的序列一致性,与鸡蛋白cystatin有31.7%的序列一致性。大黄鱼cystatin也含有典型的cystatin家族保守结构域GLy-GLy（25,26）,QLVAG（69-73）和PW（106-107）。四个半胱氨酸残基,分别为C56、C87、C98和C118。可能形成两对二硫键,维持其独特的空间结构。但大黄鱼的四个半胱氨酸残基中只有3个是与其它物种的位置是一致,另有一个半胱氨酸残基(C56)向N-端偏移,这有可能影响其空间结构的形成。另外,大黄鱼的cystatin蛋白氨基酸序列中也有S52N53残基,可能是抑制Legumain的活性位点。基因组分析表明,大黄鱼cystatin基因由3上外显子和2个内含子组成,与人、小鼠和斑马鱼的cystatin基因组结构基本一致。RT-PCR分析表明该基因在肠、鳃、心、肌、脾、肝、血和肾中为组成型表达,在脾和肾中的基因转录水平最高,在鳃、肌肉和血中最低。分别用三联灭活细菌疫苗或poLy（I:C）刺激后,该基因的mRNA水平在肾和脾中上调,在血中下调,但下调幅度不大。用pGEX-4T-2原核表达载体构建了大黄鱼cystatin（GST）重组表达载体,表达并纯化了重组Lyccys（GST）融合蛋白。以酪蛋白为底物,检测了该融合蛋白对papain的抑制比活力为40个抑制活力单位。用胶体金免疫标记电镜技术研究了大黄鱼cystatin蛋白在肾、脾组织的细胞内的定位情况。经检测表明,该蛋白主要分布在细胞质中,并附着于粗面内质网（rER）,在胞内泡状结构（如内质体或溶酶体）内有较多,细胞核内没有发现。用相对定量荧光PCR检测重组大黄鱼cystatin对免疫免疫相关基因TNF-α2和IL-10的转录水平的调节作用。结果是大黄鱼cystatin能刺激大黄鱼脾和肾中TNF-α2和IL-10 mRNA水平的上调。因此认为大黄鱼cystatin可能具有与哺乳动物cystatin相似的免疫调节功能。同时,我们也克隆了1个大黄鱼stefin全长cDNA,包含556个核苷酸,编码一个99个氨基酸组成的蛋白,分子量约11kDa。分别与纯、牛、河豚、猪、虹鳟和斑马鱼的stefin蛋白有47.5%,47.5%,46.1%,42.7%,38.0%,38.0%的序列同源性。与人和小鼠的stefin A和B蛋白分别有43.0%和38.0%,38.4%和32.0%的一致性。编码的蛋白具有stefin家族的特征结构域,即N-末端的GLy6-GLy7作用位点和一保守的QLVAG（48-51）motif。基因组分析表明,大黄鱼stefin基因由3个外显子和2内含子组成,与人、小鼠和斑马鱼的stefin基因组结构基本一致。RT-PCR分析表明该基因在肠、鳃、心、肌、脾、肝、血和肾中均有表达,其中在血和肾中的基因转录水平最高,在肠中最低。分别用三联灭活细菌疫苗或poLy（I:C）刺激后,该基因的mRNA水平在肾和脾中上调,在血中下调。用pGEX-4T-2原核表达载体构建了大黄鱼stefin（GST）（Lycstefin（GST））重组表达载体,表达并纯化出有活性的Lycstefin（GST）融合蛋白。以酪蛋白为底物,检测了该融合蛋白对papain的抑制比活力为42个抑制活力单位。用相对定量荧光PCR检测重组大黄鱼stefin对免疫相关基因TNF-α2和IL-10的转录水平的调节作用。结果是大黄鱼stefin没有引起大黄鱼脾和肾中TNF-α2和IL-10 mRNA水平的变化。用免疫电镜技术研究了大黄鱼stefin蛋白在肾、脾组织的细胞内的定位情况。经检测表明,该蛋白主要散布在细胞质中,并不附着于粗面内质网（rER）,在细胞核和胞内泡状结构（如内质体或溶酶体）内有少量分布。