论文摘要
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H.pylori）,微需氧革兰氏阴性螺旋杆菌,是人类慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病因子,与胃癌及胃MALT淋巴瘤的发生密切相关。目前,越来越多的研究证据证明,幽门螺杆菌已经适应定植于人类胃部,这种非常特殊的部位。H.pylori临床分离株普遍存在着遗传多态性,提示H.pylori存在特殊的适应性定植机制。本室在前期研究H.pylori的适应性定植中,发现刚分离的临床分离株最初很难在蒙古沙鼠中生长。然而通过在体内传代13代后,临床株便很好地在沙鼠胃中繁殖。为了进一步阐明H.pylori这种在沙鼠体内适应性定植机制,我们通过蛋白组学研究方法比较了一株临床分离的H.pylori适应性定植蒙古沙鼠后的蛋白质变化。结果从中筛选、鉴定出4个适应性定植相关蛋白。并且,首次发现和证明功能未知基因hp0318 （hugZ）与H.pylori在沙鼠中的适应性定植存在相关性。hugZ基因在H.pylori适应性定植中究竟发挥了什么样的作用?其编码蛋白的确切生理功能是什么?搞清楚这些问题将有助于解释H.pylori适应性定植机制和致病机制。本研究首先通过生物信息学的方法对hp0318（hugZ）基因进行了分析,并采用DNA重组技术克隆、表达、纯化了HP0318 （HugZ）蛋白;通过免疫电镜确定HugZ蛋白在H.pylori菌体中的具体位置;在体外利用生物化学试验检测了HugZ结合和催化血红素的功能;进一步通过同源重组基因敲除技术构建了hugZ基因突变株,定量RT-PCR检测hugZ基因表达是否受到铁的调控,探讨了该基因与H.pylori利用血红素铁之间的关系。具体研究结果如下:1.生物信息学分析hugZ基因并重组表达其编码蛋白。生物信息学分析提示hugZ与空肠弯曲菌的血红素氧合酶cj1613c基因有较高的同源性。为了检测其在血红素铁获取中的作用,我们对HugZ进行了重组表达。首先,在大肠杆菌工程菌中表达了该基因编码蛋白,并使得LB培养基变为绿色。这种现象与其它真核和原核血红素氧合酶在大肠杆菌工程菌中表达的情况一致,支持HugZ是血红素氧合酶的推断。使用镍离子亲和层析XK1610柱纯化,可以从1L菌液中得到50mg纯化蛋白样品,纯化样品在15% SDS-PAGE胶上显示为95%的纯度。基因测序与PMF检测发现重组的HugZ与H.pylori26695 hp0318基因完全符合。2.HugZ是幽门螺杆菌的胞浆蛋白。我们使用了免疫电镜对HugZ在H.pylori菌体中的位置进行定位。H.pylori 26695的菌体制备成冰冻切片,使用兔抗HugZ抗体和胶体金标记的二抗检测。H.pylori菌体冰冻切片上的胶体金颗粒位置,显示HugZ蛋白分布于H.pylori胞浆中。3.HugZ具有血红素氧合酶活性。3.1 HugZ能够结合血红素。为了检测HugZ是不是血红素氧合酶家族的一员,分别进行了两个血红素结合试验。HugZ能够特异地与Hemin-agarose结合,说明它有血红素结合能力。同样,在体外的血红素滴定光谱扫描研究结果也证实了HugZ这种结合血红素的能力。HugZ能够结合血红素形成典型的血红素结合蛋白光谱吸收峰,在411nm形成了Soret峰（血红素结合蛋白特征峰）,540nm和580nm处的峰对应了Heme-HugZβ-卟啉和α-卟啉环。定量滴定血红素结合能力发现,20μM HugZ最多能结合等量的血红素,提示HugZ与Heme按1:1分子比例进行结合。3.2 HugZ催化降解血红素。体外分别使用NADPH-CPR还原系统和抗坏血酸作为供电子体时,使用350-750nm光波扫描。发现HugZ-heme形成的Soret峰随着时间延长,逐渐降低。在缺乏反应系统任何主要成份,均不能观察到这种现象。检测中发现抗坏血酸作供电子体时,催化反应的速度明显加快,能够在20min内完成催化反应。这些发现证实了HugZ的催化降解血红素的活性。3.3 HugZ催化降解血红素生成胆绿素和CO。胆绿素是血红素氧合酶催化降解血红素的最终产物。在光谱扫描中可以观察到随着HugZ催化反应的进行,光谱图在660nm处形成胆绿素特征吸收峰。HPLC用来检测生成何种胆绿素。与胆素标准品比较发现,HugZ催化血红素生成了胆绿素IXδ.实验中加入肌红蛋白来监测催化反应中的另外一个产物-CO。铁-氧-肌红蛋白转化成铁-CO-肌红蛋白,在光谱图上显示为411nm的Soret峰向421nm漂移,并且同样可以观察到肌蛋白β-卟啉和α-卟啉环在540nm和580nm处的吸收峰。结果表明,HugZ催化降解血红素生成胆绿素IXδ和CO。4.hugZ基因在幽门螺杆菌对血红素铁的利用中起重要的作用,其基因表达受铁离子负调控。4.1 hugZ突变株不能利用血红素铁来维持正常生长。为了阐明hugZ的作用,研究首先建立了hugZ基因突变株ΔhugZ。PCR扩增hugZ基因上下游片段,在其中间插入氯霉素抗性基因（cam）克隆到质粒pBluescript SK中构建成敲除hugZ基因的自杀载体,将其转化H.pylori 26695。经同源重组,cam对hugZ基因进行置换突变,经PCR和RT-PCR鉴定和直接测序证实成功获得了hugZ基因突变株ΔhugZ。在BBF液体培养和血平板上,hugZ基因突变株生长良好与未突变株生长无显著差异。说明在铁离子丰富的条件下,hugZ不是H.pylori正常生长必需的基因。接着,我们测试了在不同铁源条件下的生长情况。结果在血红蛋白作为唯一的铁源时,hugZ基因突变株生长不良,与未突变株比较相差显著（p<0.01）。实验提示,hugZ基因缺失株不能利用血红素铁来维持正常的生长。4.2 hugZ基因表达受铁离子负调控。为了检验hugZ基因表达是不是受铁离子的调控,我们使用了定量RT-PCR检测在不同的铁离子条件下hugZ转录水平。实验发现,加入FeCl3时hugZ的转录受到了抑制（参照BBF转录水平,变化倍数为0.410±0.056 （p<0.01））;而在铁限制条件下hugZ的转录增高（参照BBF转录水平,变化倍数为3.90±0.010 （p<0.01））。表明hugZ基因转录表达受到铁离子负调控。本研究结果表明,hugZ基因编码的蛋白HugZ作为血红素氧合酶参与了幽门螺杆菌利用血红素铁,并且受到铁离子的负调控。这对于解释hugZ基因在H.pylori适应性定植中发挥的作用以及揭示H.pylori致病机制具有重要的意义。