成骨细胞对变化的流体剪应力的响应

论文摘要

本研究以Wistar新生鼠颅骨成骨细胞为研究对象,通过流动腔装置施以流体剪应力,从细胞的增殖和分化角度研究成骨细胞对流体剪应力的响应,从骨保护因子（OPG）和破骨细胞分化因子（RANKL）的基因表达角度,研究力刺激对成骨细胞调控破骨细胞的影响,考察力刺激影响骨代谢平衡可能的途径,试图探索到力刺激影响骨代谢平衡的最适宜力值以及应力方式。主要内容和结果如下:加工了对单层细胞施以流体剪应力的流动腔装置。该装置能够提供充分发散的层流态流体,并可以通过调节流动泵的转速实现对流体流量的控制,从而改变剪应力的大小,整套装置简便,受试细胞数量大,所需灌流液可控制在30 ml以内,能够对细胞进行有效的剪应力刺激,研究表明能满足各项生化指标的检测。运用原代组织块法培养了新生鼠颅骨成骨细胞,通过形态观察、Von Kossa染色鉴定表明具有成骨细胞的典型生物学行为。细胞经过传代培养大量扩增,可满足实验中数量的需要,并在培养至第三代用于力学实验。对成骨细胞施加5、10、15 dyn/cm2的单水平以及5-10-15 dyn/cm2的梯度增加和15-10-5 dyn/cm2的梯度降低的五种处理,每种处理的作用时间共12 h,梯度处理中的每个单水平作用4h。加载结束后收集受试细胞,进行测试。采用PT-PCR检测成骨细胞OPG、RANKL mRNA的表达。结果显示OPG和RANKL mRNA的表达均能受剪应力作用的影响。与静态相比,10 dyn/cm2剪应力作用能促进OPG mRNA的表达。5 dyn/cm2、梯度增加和梯度减少三种剪应力处理的作用效果次于10 dyn/cm2,但是相较于静态都促进了OPG的表达,而15 dyn/cm2的剪应力却抑制了OPG的表达。就RANKL的表达而言5和10 dyn/cm2的两种处理方式较静态有所降低,其他的剪应力处理没有表现出对成骨细胞RANKL mRNA表达的抑制作用。在5和10 dyn/cm2剪应力作用使得RANKL/OPG mRNA的平衡向着OPG占优势的方向变化,这意味着这样的处理骨吸收会受到抑制。采用流式细胞仪检测细胞周期,并计算增殖指数（proliferation index,PI）,以衡量细胞增殖能力的变化。结果显示,与静态培养的成骨细胞相比5,10 dyn/cm2的剪应力具有促进细胞增殖的作用,而15 dyn/cm2以及两种梯度加载处理都不同程度的抑制了细胞的增殖。检测了成骨细胞ALP活性和胞外钙分泌的变化,结果显示10和15 dyn/cm2剪应力处理显著的促进了成骨细胞ALP的活性,5 dyn/cm2、梯度增加和梯度减少的几种处理方式较静态而言ALP活性没有明显变化。剪应力对成骨细胞胞外钙分泌都表现出促进作用,而恒定的剪应力处理方式比梯度处理的促进效果更明显。由此认为适当的剪应力能够促进成骨细胞的分化成熟,以及矿化基质的形成。研究结果显示,成骨细胞对梯度处理与单水平处理的响应不同,显示了成骨细胞对变化的力的响应能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 骨的小管网络结构――流体剪切作用的生理基础
• 1.1.2 成骨细胞对流体剪切刺激的响应
• 1.2 骨保护因子和破骨细胞分化因子
• 1.2.1 骨保护因子
• 1.2.2 破骨细胞分化因子
• 1.2.3 OPG 与ODF 的相互关系
• 1.3 问题的提出
• 1.4 本研究的目的和内容
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 1.5 本研究创新点
• 2 流动腔装置的加工
• 2.1 引言
• 2.2 装置的加工
• 2.2.1 加工装置
• 2.2.2 结构和组成
• 2.3 流室的参数估算
• 2.3.1 流室底面剪切力估算公式
• 2.3.2 流动雷诺数估算
• 2.3.3 入口长度估算
• 2.4 结果与讨论
• 2.5 实验小结
• 3 新生鼠颅骨成骨细胞培养及鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 实验试剂和主要实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 原代细胞培养方法
• 3.3.2 成骨细胞传代培养及纯化
• 3.3.3 成骨细胞的鉴定（Von Kossa 法染色鉴定）
• 3.4 结果
• 3.4.1 原代培养和传代
• 3.4.2 Von Kossa 法染色鉴定
• 3.5 讨论
• 3.6 实验小结
• 4 流体剪应力对成骨细胞OPG 和RANKL 表达的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 主要实验仪器和试剂
• 4.2.2 细胞培养
• 4.2.3 对成骨细胞施加剪应力作用
• 4.2.4 总RNA 提取
• 4.2.5 反转录合成单链cDNA
• 4.2.6 PCR 扩增
• 4.2.7 RT-PCR 产物的分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 RT-PCR 扩增条件及循环数
• 4.3.2 剪应力作用对OPG、RANKL mRNA 表达的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 流体剪应力对成骨细胞生长行为的影响
• 5.1 引言
• 5.2 实验试剂和主要实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 细胞培养
• 5.3.2 细胞加力
• 5.3.3 细胞分裂增殖能力的检测
• 5.4 实验结果
• 5.5 讨论
• 5.6 小结
• 6 流体剪应力对成骨细胞分化和矿化的影响
• 6.1 引言
• 6.2 实验方法和步骤
• 6.2.1 成骨细胞的培养
• 6.2.2 剪应力实验
• 6.2.3 碱性磷酸酶活性的测定
• 6.2.4 胞外钙的测定
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 ALP 活性的变化
• 6.3.2 胞外钙分泌的变化
• 6.4 讨论
• 6.5 实验小结
• 7 结论及后续工作建议
• 7.1 主要结论
• 7.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录