褐飞虱对水稻品种抗性的分子反应和相关cDNA的克隆

论文题目: 褐飞虱对水稻品种抗性的分子反应和相关cDNA的克隆

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 杨之帆

导师: 何光存

关键词: 褐飞虱,水稻,品种抗性,分子反应,扩增片段长度多态性,简并扩增,快速扩增,末端,细胞凋亡

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 褐飞虱(Niaparvata lugens Stal)是水稻的主要害虫之一,它刺吸水稻韧皮部汁液,干扰光合产物的运输,影响水稻的生长和发育。大量褐飞虱取食会引起水稻的叶片干枯,分蘖枯萎,形成飞虱火烧(hopperburn)。在研究褐飞虱和水稻的互作过程中,水稻对褐飞虱取食的生理生化机理的研究固然重要,但褐飞虱在取食水稻、特别是抗性水稻后其体内的分子反应机理的研究也不容忽视,这将有利于了解褐飞虱如何通过分子水平的调控来对抗水稻的品种抗性,并最终适应新宿主这一现象,为制订科学有效的防治策略提供理论依据。 为了阐明褐飞虱在取食不同水稻品种后,其体内基因水平的调控变化,选取具有不同抗性级别的三种籼稻品种(Oryza sativa L.)作为褐飞虱的取食对象,这三种水稻是:MH63(抗性级别8,第二染色体上有一个弱小的抗性基因位点,因而对褐飞虱具有一定的抗性和耐受性)、B5(抗性级别3,高抗)和TN1(抗性级别9,感虫);所用褐飞虱为生物型2型的4龄若虫。利用cDNA-AFLP技术克隆了取食三种水稻植株后,褐飞虱体内差异表达的基因。在银染的PAGE胶上共分析了2,800个DNA条带,以取食TN1的褐飞虱若虫为对照,发现处理组(取食B5和MH63的若虫)76个DNA条带表现为上调,而只有8个表现为下调。将这84个差异表达的DNA条带从PAGE胶上切下,克隆于T载体中并进行测序。结果表明,这些cDNA序列对应的基因包括了参与信号传导、胁迫反应、基因表达调控、解毒和代谢等重要的基因。经过DNA macroarray筛选,鉴定了四个表达上调的EST,这四个EST分别对应于一个编码PP2A磷酸酶B亚基(PP2Ab)的基因、一个nemo激酶(nemo)基因、一个细胞色素P450单加氧酶(命名为CYP6AX1)基因和一个脯氨酸内肽酶(PEP)基因。Northern杂交显示PP2Ab基因只受B5的诱导,而在取食MH63H和TN1的褐飞虱中检测不到信号,表明B5植株中可能存在PP2Ab的抑制剂,作为抵御植食性昆虫侵害的防御手段,这也可能是B5具有高抗性的原因之一;该基因也可能参与褐飞虱抗逆反应的信号传递。褐飞虱中nemo基因受B5和MH63两种水稻的诱导,且表现为缓慢上调,该基因在果蝇中已被证实与细胞凋亡相关,故推测在褐飞虱取食这两种水稻后,nemo基因参与了虫体某些细胞的凋亡调控;该基因也可能参与褐飞虱其它的抗逆反应的信号传递。CYP6AX1基因在褐飞虱取食B5和MH63后6小时即达到了峰值,且始终维持较高水平,

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章 文献综述

1 褐飞虱的生物学特性及其对水稻的危害

1.1 褐飞虱的生物学特性

1.2 褐飞虱的取食特点

1.3 褐飞虱对水稻的危害

2 植物对昆虫的防御机制

2.1 直接防御作用

2.2 间接防御作用

2.3 耐受性

3 昆虫对宿主植物的适应及其防卫策略

3.1 细胞色素P450单加氧酶在昆虫取食植物中的重要作用

3.2 羧酸酯酶在昆虫取食植物中的重要作用

3.3 谷胱苷肽转移酶在昆虫取食植物中的重要作用

4 基于mRNA水平上的基因表达研究方法

4.1 mRNA差异显示技术

4.2 抑制消减杂交

4.3 基因表达系列分析

4.4 cDNA-AFLP技术

4.5 cDNA微阵列技术

5 本研究的目的和意义

第二章 从取食三种不同抗性水稻的褐飞虱中克隆差异表达的基因

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 材料

2.2.2 褐飞虱总RNA的提取

2.2.3 用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度

2.2.4 变性琼脂糖胶电泳检测总RNA的质量

2.2.5 mRNA的提取

2.2.6 cDNA-AFLP实验

2.2.7 利用点杂交验证差异表达的基因

2.2.8 Northern杂交

2.3 结果与分析

2.3.1 RNA的提取及电泳

2.3.2 mRNA的提取和cDNA的合成

2.3.3 cDNA-AFLP中的预扩增和选择扩增

2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染展示

2.3.5 差异DNA条带的克隆及测序

2.3.6 测序结果分析及点杂交验证

2.3.7 Northern杂交验证

2.4 讨论

第三章 褐飞虱解毒及毒物耐受性相关基因cDNA片段的克隆及其表达谱分析

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 材料

3.2.2 褐飞虱总RNA的提取及检测

3.2.3 简并性引物设计及合成

3.2.4 解毒和耐受性相关基因cDNA片段的扩增

3.2.5 cDNA片段的回收、连接转化和测序

3.2.6 Northern杂交和RT-PCR验证

3.3 结果与分析

3.3.1 褐飞虱中解毒和耐受性相关基因的cDNA片段的克隆

3.3.2 测序结果及分析

3.3.3 Northern杂交和RT-PCR检测基因的表达

3.4 讨论

第四章 解毒和毒物耐受性相关基因全长cDNA的克隆和序列分析

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 RACE引物的设计及合成

4.2.2 褐飞虱总RNA的提取及检测

4.2.3 SMART RACE反应

4.2.4 快速扩增cDNA末端(RACE)

4.2.5 RACE DNA片段的连接转化及测序

4.2.6 cDNA全长序列分析

4.2.7 Sorthern杂交检测ACE基因的拷贝数

4.3 结果与分析

4.3.1 乙酰胆碱酯酶全长cDNA的克隆及序列分析

4.3.2 细胞色素P450 CYP6AX1和CYP6AY1全长cDNA的克隆及序列分析

4.3.3 nemo激酶全长cDNA的克隆及序列分析

4.3.4 NQO全长cDNA的克隆及序列分析

4.3.5 胰蛋白酶全长cDNA的克隆及序列分析

4.4 讨论

第五章 取食不同抗性水稻的褐飞虱中肠细胞及组织结构变化

5.1 引言

5.2 材料和方法

5.2.1 材料和试剂盒

5.2.2 石蜡切片

5.2.3 TUNEL反应及检测

5.2.4 DAPI染色反应及观察

5.3 结果与分析

5.3.1 TUNEL检测

5.3.2 DAPI检测

5.4 讨论

总结与展望

参考文献

附录Ⅰ 常用试剂配方

附录Ⅱ 在读期间发表及待发表的论文

致谢

发布时间: 2006-03-27

参考文献

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