磁性纳米载体的制备及其固定化脂肪酶催化性能研究

论文摘要

磁性高分子微球是近年发展起来的一种新型功能高分子材料,在生物医学、分子生物学、分离工程、细胞学和生物工程等领域有着广泛的应用前景。用磁性高分子作为酶的固定化载体的研究对于磁性复合载体在固定化酶的应用中提供了理论和试验基础,同时也为降低脂肪酶利用成本,解决我国生物柴油酶法生产产业化问题进而提高其可行性和国际竞争力提供了较好的参考方案。和其他磁性材料相比,Fe304具备良好的氧化稳定性和较低的毒性,并且由于有不同的化学组成结构,从而可得到不同的磁性能,常用作磁性微球中的磁核。用磁性高分子作为酶的固定化载体的优点在于它在外加磁场的作用下被磁化而定向移动,可以从反应体系中被分离出来；当撤离外加磁场后,超顺磁性纳米颗粒又可以重新悬浮到反应体系中,具有良好的分散性能与可操控性。本论文主要研究了磁性复合载体的制备条件及其固定化脂肪酶的条件,并对固定化酶的酶学性质进行了探讨,主要研究结果如下：磁性复合Fe3O4-SiO2载体制备。先利用改良的共沉淀法制备Fe3O4磁流体,再用溶胶-凝胶法制备磁性复合Fe304-SiO2载体。在扫描电镜观测的形态说明,该磁性复合载体呈球体状,单分散性良好,平均粒径约为300nm左右。磁性复合Fe3O4-SiO2载体经硅烷偶联剂在其表面氨基化后,在傅里叶变换红外光谱仪下检测氨基已加至载体表面。磁性复合Fe304-SiO2载体固定化脂肪酶条件进行优化。由单因素实验确定各单素的最佳条件：酶与载体配比、戊二醛浓度、固定化温度、固定化时间分别为16：5g/g、8%、25℃、4 h。在此基础上,选取为酶与载体配比、戊二醛浓度和固定化温度进行Box-Behnken实验,对固定化脂肪酶的条件进一步优化,借助Design-Expert 7软件对实验数据进行统计分析,拟合出描述酶活与实验条件之间关系的数学模型,确定最适固定化条件为：酶与载体配比为3.32：1g/g、戊二醛浓度为8.20%、固定化温度为23.88℃时,固定化脂肪酶的酶活达到理论最大值3440.74 U/g。在以上确定的条件下进行重复的三组固定化试验,结果所得固定脂肪酶的平均酶活为3430±1.55U/g,与模型预测值相差为0.28%,说明所建立的模型与试验结果相符,此时蛋白固载量为79.21%,酶活回收率为72.46%,与响应面优化之前相比分别提高了7.93%和10.36%。固定化酶酶学性质的探讨。通过比较游离酶与固定化酶的最适温度和热稳定性等性质,研究了固定化酶的重复使用率。实验结果表明,游离酶的Km为3.817mmol,Vm为0.041 nmol/min·L,固定化酶的Km为5.714mmol, Vm为0.087μmol/min·L。与游离脂肪酶相比,最适反应温度、热稳定性、最适反应pH值、pH稳定性等均无太大变化,但是热稳定性和pH稳定性均有所增加,说明固定化操作对游离脂肪酶的稳定性有一定的提高。固定化脂肪酶在重复使用8次后,酶活回收率仍为的36.4%（相对酶活,以4℃保存的固定化酶活力为100%）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 磁性纳米载体
• 1.1.1 磁性纳米载体简介
• 1.1.2 磁性纳米载体的制备
• 1.1.3 磁性高分子微球的性质
• 1.1.4 纳米磁性粒子表面改性
• 1.2 脂肪酶固定化
• 1.2.1 简介
• 1.2.2 固定化方法
• 1.2.3 固定化方法小结
• 1.3 磁性载体在脂肪酶固定化中的应用
• 1.4 固定化脂肪酶催化生产生物柴油
• 1.5 研究目的意义
• 1.6 研究内容
• 2 载体制备条件优化及表面改性
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 主要分析方法
• 2.2.4 实验方法
• 2.2.5 单因素实验
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 磁响应性
• 2.3.2 载体SEM图
• 2.3.3 红外图谱分析
• 2.4 小结
• 3 固定化脂肪酶条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 主要试剂配制
• 3.2.3 仪器
• 3.2.4 实验方法
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 酶与载体配比对固定化脂肪酶活力的影响
• 3.3.2 戊二醛浓度对固定化脂肪酶活力的影响
• 3.3.3 固定化时间对固定化脂肪酶活力的影响
• 3.3.4 固定化温度对固定化脂肪酶活力的影响
• 3.3.5 响应面结果分析
• 3.3.6 二次回归拟合及方差分析
• 3.3.7 最佳条件的取得及试验验证
• 3.4 小结
• 4 固定化脂肪酶的酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 实验方法
• 4.3 结果分析
• m测定'>4.3.1 固定化脂肪酶与游离酶的表观米氏常数K_m测定
• 4.3.2 固定化脂肪酶与游离酶的最适温度
• 4.3.3 固定化脂肪酶与游离酶的热稳定性
• 4.3.4 固定化脂肪酶与游离酶的最适pH值
• 4.3.5 固定化脂肪酶与游离酶的pH稳定性
• 4.3.6 固定化脂肪酶的重复利用率及操作稳定性
• 4.4 小结
• 5 结论与展望
• 6 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢