小麦叶黄素循环关键酶基因的表达与功能分析

论文摘要

当植物吸收的光能过剩超过其电子传递所需时,过剩光能便会造成光合效率和光合功能的降低,严重时还会发生光氧化破坏。植物在长期的进化过程中形成了多种光保护机制,可将过剩激发能对光合机构的损伤减小到最低程度,其中叶黄素循环被认为在植物防御光氧化破坏中起着重要作用。所谓的叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时,双环氧的紫黄质（V）在紫黄质脱环氧化酶（VDE）的催化下,经过中间物单环氧的花药黄质（A）转化为无环氧的玉米黄质（Z）;在暗处,则在玉米黄质环氧化酶（ZE）的作用下朝相反方向进行,将Z经A重新环氧化为V,形成一个循环。其中紫黄质脱环氧化酶（VDE）和玉米黄质环氧化酶（ZE）是该循环的关键酶。因此,弄清叶黄素循环的功能以及该循环的调控机理具有非常重要的意义。本文以小麦（旱丰9703）为材料,利用RT-PCR克隆了小麦紫黄质脱环氧化酶基因（WVDE）和玉米黄质环氧化酶基因（WZE）,并分析了两个基因在小麦中的表达特征。构建了WVDE和WZE基因反义表达载体,并转化烟草,探讨了转基因烟草耐低温弱光和强光胁迫能力的变化。主要结果如下:1、根据已知序列设计特异引物,通过RT-PCR的方法从小麦叶片中克隆了小麦紫黄质脱环氧化酶和玉米黄质环氧化酶基因的中间片段序列。2、Northern杂交结果表明,WVDE表达量随强光和低温弱光处理时间的延长逐渐增大,6小时达到最大,之后逐渐稳定。WZE的表达趋势与WVDE的相似。不同光强、不同温度条件下WVDE和WZE表达趋势基本相同,说明WVDE和WZE在RNA水平的表达不受温度和光强的影响,而是受到内生节律的调控。3、将获得的小麦紫黄质脱环氧化酶基因和小麦玉米黄质环氧化酶基因分别与含有35S启动子的PBI121载体重组,构建了反义表达载体,利用农杆菌介导法转入烟草中,获得了转基因烟草。在低温弱光及强光胁迫条件下,依赖叶黄素循环的NPQ能够耗散过剩激发能,而转WVDE基因烟草比野生型耗散能力下降;强光处理过程中,与野生型相比转基因烟草的Fv/Fm降低更明显,且野生型的Fv/Fm恢复较快,转基因植株恢复较慢。低温弱光处理时,野生型和转基因株系Fv/Fm降低程度要小于强光胁迫,但总的变化趋势基本相同,这表明WVDE的抑制加重了PSII的光抑制程度,与野生型相比,转基因烟草的PSII反应中心受伤害较严重;强光胁迫6 h和12 h,野生型和转基因烟草的放氧速率降低非常显著,低温弱光处理6 h和12 h,野生型和转基因烟草的放氧速率都降低,但下降程度不如强光处理下的明显。这表明由于VDE的表达抑制降低了低温弱光和强光胁迫下放氧复合体的稳定性,使光合机构所受到的伤害加重;对野生型和转WZE基因烟草进行同样的强光和低温弱光胁迫处理,但两者之间似乎差别不大。4、对转WVDE基因植株和野生型烟草的幼叶与成熟叶分别进行northern杂交分析,结果显示VDE基因在烟草幼叶当中的表达水平要比成熟叶的高。进一步测定强光胁迫条件下幼叶与功能叶的光合和荧光参数,幼叶受强光胁迫的影响要比功能叶小的多。膜脂测定结果显示,幼叶当中不饱和脂肪酸的含量要稍高于功能叶,或许这也是导致幼叶的抗光氧化能力高于成熟叶的原因之一。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 光合作用的光抑制
• 1.1.1 光抑制的原理
• 1.1.2 光抑制、光破坏的防御
• 1.1.2.1 减少光吸收、增加光能利用能力
• 1.1.2.2 状态转换
• 1.1.2.3 增加热耗散
• 1.1.2.4 光呼吸
• 1.1.2.5 Mehler 反应
• 1.2 高等植物体内的叶黄素循环
• 1.3 叶黄素循环的主要功能
• 1.3.1 热耗散
• 1.3.2 防止膜脂过氧化
• 1.3.3 稳定类囊体膜结构
• 1.3.4 对蓝光的响应
• 1.3.5 参与ABA 合成途径
• 1.4 叶黄素循环能量耗散的分子机理
• 1.5 紫黄质脱环氧化酶
• 1.5.1 分子特性
• 1.5.2 紫黄质脱环氧化酶的调节
• 1.5.2.1 pH 值
• 1.5.2.2 抗坏血酸（AsA）
• 1.5.2.3 DTT
• 1.5.2.4 温度
• 1.5.2.5 UV-B
• 1.5.2.6 膜脂
• 1.6 玉米黄质环氧化酶（ZE）
• 1.7 研究的目的、意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料与处理
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 材料处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 利用TRIZOL 试剂盒提取RNA
• 2.2.2 RNA 反转录
• 2.2.3 小麦紫黄质脱环氧化酶基因和玉米黄质环氧化酶基因中间片段的克隆
• 2.2.4 电泳目的基因片段的回收
• 2.2.5 克隆载体的构建
• 2.2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5.2 连接
• 2.2.5.3 转化及克隆筛选
• 2.2.5.4 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.5.5 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.5.6 序列测定
• 2.2.6 表达载体的构建
• 2.2.6.1 碱法大量提取质粒DNA
• 2.2.6.2 载体构建
• 2.2.7 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备及转化
• 2.2.7.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7.2 冻融法转化农杆菌
• 2.2.8 农杆菌介导转化烟草
• 2.2.9 转基因烟草的PCR 检测
• 2.2.9.1 CTAB 法提取基因组DNA
• 2.2.9.2 转基因植株的PCR 筛选
• 2.2.10 Northern 杂交
• 2.2.10.1 RNA 提取及电泳
• 2.2.10.2 转膜及烘膜
• 2.2.10.3 探针合成
• 2.2.10.4 预杂交、杂交及放射自显影
• 2.2.11 生理指标的测定
• 2.2.11.1 光合参数的测定
• 2.2.11.2 荧光参数的测定
• 2O₂）含量的测定'>2.2.11.3 过氧化氢（H₂O₂）含量的测定
• 2.2.11.4 放氧活性的测定
• 2.2.11.5 叶片膜脂成分测定
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦VDE 与ZE 基因的克隆
• 3.2 小麦VDE 和ZE 基因的表达特性分析
• 3.2.1 强光和低温弱光处理不同时间下WVDE 的表达特性
• 3.2.2 强光和低温弱光处理不同时间下WZE 的表达特性
• 3.3 WVDE 和WZE 转化烟草
• 3.3.1 反义表达载体的构建
• 3.3.2 表达载体的检测
• 3.3.2.1 表达载体的PCR 检测
• 3.3.2.2 表达载体的酶切检测
• 3.3.3 烟草的组培体系
• 3.3.4 转基因植株的鉴定
• 3.4 强光和低温弱光胁迫下转反义 WVDE 基因烟草光合和叶绿素荧光参数的变化
• 3.4.1 转反义WVDE 基因烟草叶片净光合速率的变化
• 3.4.2 转反义WVDE 基因烟草Fv/Fm 的变化
• 3.4.3 转反义WVDE 基因烟草 NPQ 的变化
• 3.4.4 转反义WVDE 基因烟草叶片过氧化氢含量的变化
• 3.4.5 转反义WVDE 基因烟草放氧速率的变化
• 3.5 强光和低温弱光胁迫下转反义 WZE 基因烟草光合和叶绿素荧光参数的变化
• 3.5.1 转反义WZE 基因烟草叶片净光合速率的变化
• 3.5.2 转反义WZE 基因烟草Fv/Fm 的变化
• 3.5.3 转反义WZE 基因烟草 NPQ 的变化
• 3.5.4 转反义WZE 基因烟草叶片过氧化氢含量的变化
• 3.5.5 转反义WZE 基因烟草放氧速率的变化
• 3.6 叶黄素循环在烟草叶片中的表达与叶龄的关系
• 3.6.1 强光胁迫下转WVDE 基因烟草和野生型植株不同叶龄叶片VDE 的表达水平
• 3.6.2 强光胁迫下转基因烟草和野生型烟草幼叶与功能叶光合速率（Pn）的变化
• 3.6.3 强光胁迫下转基因烟草和野生型烟草YL 与ML Fv
• 3.6.4 强光胁迫下野生型和转基因烟草YL 与ML φPSⅡ的变化
• 3.6.5 强光胁迫下转基因烟草和野生型烟草YL 与ML NPQ 的变化
• 3.6.6 WT 烟草叶片类囊体膜脂肪酸组成情况
• 4 讨论
• 4.1 小麦叶黄素循环关键酶基因的表达特性
• 4.2 转WVDE 反义基因加重烟草的光抑制
• 4.3 光保护作用对玉米黄质（Z）的消耗存在速率问题
• 4.4 叶黄素循环在烟草叶片当中的表达状况与叶龄有关
• 5 主要结论
• 参考文献
• 致谢