论文题目: 人胚胎干细胞低温保存问题的初步研究
论文类型: 硕士论文
论文专业: 制冷及低温工程
作者: 杨鹏飞
导师: 华泽钊
关键词: 低温保存,人胚胎干细胞,猪骨髓基质干细胞,人骨髓基质,干细胞,渗透特性,冷冻干燥
文献来源: 上海理工大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究受到华泽钊教授所负责的国家自然科学基金重点资助项目“临床医学中若干热物理问题的研究”、“现代药品与食品真空冷冻干燥过程中传热传质问题的研究” （项目编号：50376040）和上海市重大科技攻关项目“人体细胞的冻存复苏和体外大规模培养扩增技术”（项目编号：00DJ14001-6）的资助。根据本研究所及上海市组织工程研究与开发中心的研究现状及现有条件，进行了人胚胎干细胞程序降温保存的试验、猪骨髓基质干细胞渗透特性和人骨髓基质干细胞冷冻干燥的试验。 干细胞研究是探索有关单个细胞发展为一个生物有机体，以及在成熟的机体内健康细胞替换衰老和受损伤细胞的规律和机制的研究。它们在临床的应用前景广阔，最主要和常见的用途是修复或重建患病或损伤的组织。由于低温能大大降低生物体新陈代谢的速率，所以干细胞能够在液氮温度下安全地保存数十年以上，而不发生变化，因此干细胞低温保存将在组织工程、细胞移植和基因治疗等领域中发挥重要作用。 胚胎干细胞具有广阔的应用前景。可用于研究人胚胎发育及其疾病的发生；可产生细胞和组织，将其用来修复或替换丧失功能的组织和器官；可发展为特化细胞，从而可望用细胞治疗许多疾病。但体外培养胚胎干细胞条件十分繁琐，而且费时费力。另外建系后的细胞经长期培养后会出现变异，如核型出现异常，未分化细胞的克隆率相应地减少或降低等。因此，希望能在胚胎干细胞建系后或在其早期传代中，将其加以低温保存，到使用时再将其升温复苏。经低温保存后的胚胎干细胞必须存活，而且要保持其未分化状态及其他生物学特性。因此低温保存就成为必需解决的急迫问题。国内外对胚胎干细胞的程序降温保存的研究不是很多，一般采用简单的两步降温法。这种慢速冻存与快速复温的方法对鼠胚胎干细胞的保存是有效的，但对于人胚胎干细胞来说，存活率较差。 本文初步研究了人胚胎干细胞低温保存问题，较详细的探讨和比较了几种因素对冻存复苏后胚胎干细胞的存活率、活力及分化特性的影响，如：降温速率、置核温度、保护剂和投入液氮前温度等。结果表明：采用Me2SO+血清+DMEM（体积比为1:3:6）的保护剂，从0℃开始，以0.5℃／min的速率对细胞悬液降温；至-10℃时对其进行置核，并于-35℃时将其快速投入液氮中保存，复温后效果最佳。冻存复温后细胞存活率可达81.8％，复苏后的胚胎干细胞形态和集落生长方式都与冻前的生长形态相同，且胚胎干细胞标志之一碱性磷酸酶（AKP）反应阳性，同时染色体组型仍正常。除此之外，本文还研究了猪骨髓基质干细胞的渗透特性。利用细
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
第一章 研究干细胞的意义
§1.1 干细胞定义与特性
§1.2 胚胎干细胞
§1.3 成体干细胞
§1.3.1 骨髓基质干细胞
§1.4 胚胎干细胞与成体干细胞的关系和特点
§1.5 干细胞潜在的用途
第二章 干细胞的渗透特性
§2.1 细胞膜对水分的渗透性质
§2.1.1 细胞膜概述
§2.1.2 冻结过程中的水分渗透情况
§2.2 细胞几何尺寸及不可渗体积的确定
§2.3 猪骨髓基质干细胞渗透特性
§2.3.1 材料与方法
§2.3.2 结果与分析
§2.3.3 讨论
第三章 细胞的低温保存概况
§3.1 细胞低温保存与低温损伤
§3.1.1 Arrhenius关系
§3.1.2 危险温度区
§3.1.3 低温损伤的热学机理
§3.2 细胞及组织低温保存的物理化学基础
§3.2.1 危险温度区冷冻过程
§3.2.2 复温过程
§3.2.3 冻融过程的复杂性及其对组织细胞的影响
§3.3 细胞及组织低温保存的基本方法
§3.3.1 低温保存的基本方法和技术
§3.3.2 影响细胞及组织低温保存效果的因素
§3.3.3 溶液的玻璃化转变
§3.4 细胞的低温保存
§3.4.1 骨髓的低温保存
§3.4.2 胎肝干细胞的低温保存
§3.4.3 外周血干细胞的低温保存
第四章 人胚胎干细胞的程序降温冻存试验
§4.1 胚胎干细胞低温保存现状
§4.2 程序降温试验材料与方法
§4.3 程序降温试验结果与分析
§4.3.1 不同降温速率对试验的影响
§4.3.2 置核方法的应用
§4.3.3 样品于不同温度投入液氮对试验的影响
§4.3.4 不同保护剂的比较
§4.3.5 复温后ES细胞碱性磷酸酶和染色体组型的测定
§4.4 讨论与结论
第五章 干细胞的冷冻干燥
§5.1 冷冻干燥法在细胞保存中的应用
§5.1.1 微生物细胞结构与功能的统一有利于冷冻干燥保存
§5.1.2 保护剂系统对微生物冻干保护效应
§5.1.3 冻干导致微生物细胞致死损伤的机理
§5.2 细胞冷冻干燥的研究现状
§5.3 脐血干细胞的冷冻干燥保存
第六章 人骨髓基质干细胞的冷冻干燥的试验探索
§6.1 骨髓基质干细胞低温保存现状
§6.2 冻干保护剂的选取与配制
§6.2.1 保护剂的选取
§6.2.2 玻璃化溶液
§6.2.3 保护剂的配制
§6.3 应用DSC测量保护剂参数
§6.3.1 DSC简介
§6.3.2 DSC在实验中的应用
§6.4 冻干实验
§6.5 冻干细胞活性的测定
§6.6 结论
第七章 结论与展望
参考文献
在读期间公开发表的论文
致谢
发布时间: 2007-06-08
参考文献
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