论文摘要
(一)Egh16家族基因的敲除与功能分析稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起水稻的重要病害——稻瘟病,了解其致病机制对稻瘟病菌的防治意义重大。同时,作为丝状真菌致病机理与分子生物学研究的重要模式,稻瘟病菌有着典型的侵染过程,包括产孢、孢子萌发和附着孢的分化。稻瘟病菌功能基因的研究可以为其它丝状真菌的研究提供研究思路。稻瘟病菌侵入前过程,特别是附着孢的分化与形成,已经有很好的研究基础,但病菌的侵染循环中仍然有多个环节的机制十分不清楚,例如侵入后病菌的定殖、菌丝分化和扩展的机制、各细胞器在侵染中的作用等等。Egh16是通过差减杂交方法在小麦白粉病菌(Blumeria graminis)中首先发现的一类在侵入后特异表达的基因。在多种植物病原真菌中都发现其同源基因,其中包括稻瘟病菌中两个已知的重要致病相关基因GAS]和GAS2。另外,在镰刀菌中,其同源基因也在侵入后特异表达。因此,推测Eghl6是植物病原真菌中一类参与致病过程的重要的基因家族。通过同源基因检索,我们在稻瘟病菌基因组中获到8个Eghl6基因(包括GAS1与GAS2)。为了进一步明确Egh16基因家族基因与致病性的关系,包括在附着胞形成、侵入及侵入后生长过程中的作用等,本研究克隆了稻瘟病菌的3个Egh16家族基因MG02253、MG00703、MG09875,运用基因敲除的方法获得了3个基因的突变体,并初步分析了突变体的表型。结果如下：1利用小麦白粉病菌Egh16基因蛋白序列,在稻瘟病菌基因组数据库中通过blast程序进行同源序列检索,检索到8个假设基因(MG02253、MG00703、MG09875、MG03504、MG00992、MG11595、GAS1、GAS2)。序列分析表明,MG02253基因开放阅读框长度为1067bp,包含、1个内含子,2个外显子,编码区总长度为843bp,编码280氨基酸残基的多肽；MG00703基因开放阅读框长度为1053bp,包含1个内含子,2个外显子,编码区总长度为969bp,编码322氨基酸残基的多肽。MG09875基因开放阅读框长度为925bp,包含1个内含子,2个外显子,编码区总长度为828bp,编码275氨基酸残基的多肽。2通过构建基因置换载体和两次ATMT转化,其中,MG02253基因得到75个转化子,MG00703基因得到72个转化子,MG09875基因得到73个转化子。通过PCR和Southern杂交验证,每个基因在其中鉴定出6个突变子,每个突变子基因编码区的90%被HPH基因所取代。各基因随机选取2个突变体进行表型分析。3通过Southern分析,明确了MG02253、MG00703、MG09875三个基因在Guy11菌株基因组中均为单拷贝。4各基因突变子在不同培养基上的菌落形态与生长速度无明显改变,包括在N饥饿、C饥饿或高渗胁迫条件下,菌落形态及生长速度与野生型比较也无明显改变。5将各基因的突变体的孢子悬浮液滴在Terylene膜表面诱导萌发与附着胞的形成。结果显示,所有菌株的孢子几乎全部萌发,突变体与野生型的萌发速度几乎无差别,附着孢形成率达到95%以上,且可正常侵入,形成侵染菌丝。6各基因突变体与野生型和随机插入菌株均能产生典型的黄褐色病斑,差别不明显,且致病能力较一致。7各基因突变子在OMA培养基上与2539菌株交配,子囊壳的产生不受影响,不影响稻瘟病菌的有性生殖。(二)稻瘟病菌对二穗短柄草的致病性研究作为植物与病原真菌互作研究中模式生物,稻瘟病菌与不同寄主(甚至非寄主)之间的互作及不同互作系统之间的异同,对于明确真菌与植物互作机理以及发掘新的抗性资源具有积极意义。而到目前,稻瘟病菌与其他寄主的互作研究和应用还相对较少。二穗短柄草(Brachypodium distachyon)是一种新型的禾本科模式植物,对多种重要的植物病原真菌敏感,有望成为稻瘟病菌与寄主互作的研究材料之一。通过探索稻瘟病菌对二穗短柄草的接种与发病条件,观察二穗短柄草的发病特点,并与大麦上的发病情况进行比较,本研究初步建立了稻瘟病菌对二穗短柄草的接种方法和发病体系。主要结果如下：1.在人为接种稻瘟病菌的条件下,二穗短柄草的叶片、叶鞘、茎秆、穗部均可获病。利用稻瘟病菌分生孢子悬浮液对二穗短柄草苗期进行活体或离体接种,都能引发典型病斑。2.与同等条件下的大麦相比,二穗短柄草叶片上病斑的出现时间及发展速度更接近水稻。同时,二穗短柄草叶片上的接种和发病条件比水稻更易控制,病斑更具一致性。3.另外,稻瘟病菌致病突变体在二穗短柄草叶片上致病性变化(降低或丧失)的趋势与在水稻上的情况一致。4.显微观察及组织化学染色表明,稻瘟病菌在二穗短柄草叶片上可有效的形成附着胞,侵入叶片表皮细胞,形成典型的侵染菌丝,其过程与水稻近似。