论文摘要
当今,我们所使用的抗生素都是微生物的次级代谢产物。由于抗生素的滥用,不可避免地导致耐药微生物的产生,对人类自身生存和发展产生很大的威胁。而解决微生物耐药问题的一个有效途径就是研制出与传统抗生素作用机制不同的新型抗菌药。抗菌肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物活性的小分子多肽,广泛地存在于自然界中,其中许多抗菌肽具有直接抗微生物活性,能作用于G-、G+细菌、真菌、寄生虫甚至是包膜病毒,并且在宿主先天免疫和适应性反应中有重要的调节作用。近来,越来越多的证据表明抗菌肽是有效的免疫辅助因子,能够与其他的众多免疫效应子协同作用,从而起始适应性免疫,促进伤口愈合,抑制前炎症反应以及诱导和调节细胞因子和趋化因子的产生。另外,随着抗菌肽作用机理逐渐被揭开,将这些内源性肽及其衍生物制成抗感染治疗药剂将会有广阔的应用前景。鸡Fowlicidins是一种线性阳离子小分子多肽,有着强大的、盐不依赖性的、广谱的抗菌活性,能作用于G+、G-细菌甚至是抗性菌株,并且具有LPS结合活性和中和活性,使其成为理想抗菌药物的候选者。鸡Fowlicidin-1及其衍生物具有高效广谱抗菌等多种生物学功能。其衍生肽Fowlicidin-18-26是由19个氨基酸残基组成的阳离子型抗菌肽,由于氨基酸序列的优化,其功能活性较Fowlicidin-1有所提高,且本身不含稀有氨基酸和外源化学成分,所以是一种极具应用潜力的健康安全的抗菌替代物。目前尚没有利用基因工程方法制备Fowlicidin-1的相关报道,所以本课题拟利用大肠杆菌表达系统中实现抗菌肽Fowlicidin-1活性片段（Fowlicidin-18-26）的大规模表达,为基因工程方法规模化生产抗菌肽Fowlicidin-18-26及其它贵重肽类奠定了理论与实践基础,对建立抗菌肽基因工程菌和抗菌肽研究的共性技术具有重要意义。本试验主要结果如下:1.根据抗菌肽Fowlicidin-1活性片段Fowlicidin-18-26的氨基酸序列,按照大肠杆菌密码子偏爱性,采用SOE技术,设计合成了Fowlicidin-18-26的编码基因:c-Fowlicidin-1和d-Fowlidicidin-1;2.利用BglⅡ和BamHⅠ同尾酶,将c-Fowlidicidin-1基因片段重组到原核表达载体pET-32a,构建出串联多聚体表达载体p-c-Fowlidicidin[1-6],在大肠杆菌中BL21 （DE3）中诱导表达含Fowlidicidin-1的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量。结果是在含有单拷贝的p-c-Fowlidicidin表达载体中c-Fowlidicidin-1融合蛋白有很低的表达量,而在余下载体中未见目的蛋白表达;3.将d-Fowlidicidin-1基因片段重组到原核表达载体pET-32a,构建出表达载体p-d-Fowlidicidin,并将其转化到E.coli BL21中。经IPTG诱导,利用SDS-PAGE和Western blot确定了d-Fowlidicidin-1融合蛋白的表达。对常规表达条件进行优化,结果表明在25℃、OD600菌密度0.8左右、IPTG浓度0.6mmol/L、诱导时间为11h的条件下,融合蛋白表达量达到最高,并且可溶性d-Fowlicidin-1融合蛋白在总可溶性蛋白中所占比例超过了70%。引入了一种新型高效的复合自动诱导培养基,可溶性d-Fowlicidin-1融合蛋白的表达量与条件优化后的LB培养基相比提高了10倍以上。经Ni2+亲和层析后回收d-Fowlicidin-1融合蛋白,纯度达到了85%以上。对纯化的融合蛋白进行酶切,用液体生长抑制方法检测切割后样品的活性,表明重组抗菌肽Fowlicidin-1对大肠杆菌（E.coli）、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、产单孢李氏菌（L.monocytogenes）及金黄色葡萄球菌（S.aureus）有抑制作用。