养殖刺参“腐皮综合征”致病菌的鉴定及其灭活菌苗对刺参免疫作用的研究

论文摘要

刺参（Apostichopus japonicus,又称仿刺参）,属棘皮动物门（Echinodemata）、海参纲（Holothuroidea）、仿刺参属（Apostichopus）,主要分布于中国黄渤海、俄罗斯东部海岸、日本和韩国沿岸,是海参种类中食用和药用价值最高的品种。近年来,我国大力发展刺参养殖业,使其一跃成为中国北方沿海水产养殖的重要新兴产业,取得了显著的经济效益和社会效益。仅山东省2007年刺参养殖面积达45万亩,年产量78万吨,经济产值达到百亿元,刺参成为当前中国海水养殖业中产值最大的养殖品种之一。然而,由于养殖的过速发展和不规范运作,刺参病害问题日趋突出,出现了多种明显病症和大规模死亡现象。其中,越冬保苗期和养成期出现的“腐皮综合征”是目前养殖刺参危害最为严重的疾病,给广大刺参养殖业者造成了严重的经济损失,也严重制约了该产业的持续稳定发展。多年来,人们主要采用抗生素对其病症进行预防和治疗,但抗生素的大量使用会造成耐药性的产生,使疾病的治愈难度越来越大。同时,也可能产生药物残留影响产品质量。由此可见,提高刺参自身的免疫力,增强其抗病力是解决刺参病害问题的重要途径。因此,在水产养殖疾病防治方面,利用外源刺激物（免疫增强剂、疫苗等）有效地提高养殖对象本身的免疫力显得非常重要。迄今为止,有关灭活菌苗对刺参免疫影响的研究较少见。2007年67月,对烟台三家养殖场患“腐皮综合征”养成期刺参进行了病原学研究,患病刺参主要症状厌食、摇头、肿嘴、排脏、口部溃烂乃至体表大面积溃疡,出现大量死亡。从病灶部位分离得到了一种菌落形态一致的优势菌HS-yt,通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对其菌株进行的分类鉴定表明,HS-yt是气单胞菌属（Aeromonas sp.）的一种,与Aeromonas veronii相似性最大。通过人工感染试验证实其为刺参“腐皮综合征”的致病原。本文首先从预设的5个常用的评价免疫增强剂对无脊椎动物免疫作用的酶活力指标中筛选出3个变化有规律的指标。结果表明溶菌酶、超氧化物歧化酶及碱性磷酸酶为变化较规律的3个指标,并将其作为进一步试验的免疫指标。将致病菌HS-yt制备成甲醛灭活菌苗后对健康刺参进行体腔注射,测定了灭活气单胞菌苗对刺参免疫指标的影响。结果表明,刺参血清中溶菌酶活力在注射菌苗后,3.9×108CFU/mL组于6h时活力就达到峰值,而4.7×107CFU/mL组的活力在24h时达到最高值,试验组的溶菌酶活力明显高于对照组（P<0.05）。在3.9×108CFU/mL组中,碱性磷酸酶活力于48h时达到最高值;而4.7×107CFU/mL组在96h时达到最高值,试验组的碱性磷酸酶活力明显高于对照组（P<0.05）。相比之下,注射菌苗对血清的超氧化物歧化酶活力影响却不显著。总体上,该菌苗在一定程度上可以提高刺参的机体免疫力。实验结果也证实,注射高浓度菌苗时,溶菌酶、碱性磷酸酶活力的达峰时间较短而且显著,但其酶活力升高持续时间较短。本研究中灭活气单胞菌苗能够显著的提高刺参碱性磷酸酶和溶菌酶活力,显示了该菌苗可以提高刺参的机体免疫力,说明刺参在外源刺激物的作用下可提高自身免疫力。这为深入研究刺参免疫学提供了理论依据,同时也为养殖刺参“腐皮综合征”的防御开辟了新的途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 1 文献综述
• 1.1 我国海参养殖发展现状
• 1.2 国内外养殖海参疾病研究进展
• 1.2.1 养殖海参常见细菌性疾病的研究现状
• 1.2.1.1 刺参育苗期细菌性疾病
• 1.2.1.2 刺参保苗及养成期细菌性疾病
• 1.2.2 其他疾病
• 1.3 微生物类免疫增强剂的研究进展
• 1.3.1 肽聚糖（PG）
• 1.3.2 脂多糖（LPS）
• 1.3.3 葡聚糖
• 1.3.4 胞壁酰二肽
• 1.3.5 微生态制剂（Microecologics）
• 1.3.6 疫苗
• 1.3.7 小结
• 1.4 棘皮动物免疫防御机制的研究进展
• 1.4.1 棘皮动物体腔细胞分类
• 1.4.2 体腔细胞的吞噬和包囊
• 1.4.3 体腔细胞的呼吸爆发现象
• 1.4.4 水解酶类
• 1.4.5 酚氧化酶
• 1.4.6 免疫因子
• 1.4.6.1 细胞因子
• 1.4.6.2 凝集素和溶血素
• 1.4.6.3 补体样物质
• 参考文献
• 2 养成期刺参“腐皮综合征”致病菌的分离鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 优势菌株的分离及纯化
• 2.1.3 人工感染试验
• 2.1.3.1 试验用参
• 2.1.3.2 菌悬液制备
• 2.1.3.3 攻毒试验
• 2.1.4 优势菌的分类鉴定
• 2.1.4.1 形态学观察
• 2.1.4.2 生理生化测定
• 2.1.4.3 优势菌的16S rDNA 序列分析
• 2.1.5 优势菌药物敏感实验
• 2.2 结果
• 2.2.1 优势菌分离结果
• 2.2.2 人工感染试验结果
• 2.2.3 形态学观察
• 2.2.4 生理生化特性
• 2.2.4.1 病原菌对pH、温度、NaCl 含量的耐受性
• 2.2.4.2 生理生化试验及API 试验条鉴定结果
• 2.2.5 16S rDNA 基因序列同源性分析及系统发育树构建
• 2.2.5.1 16S rDNA 基因扩增
• 2.2.5.2 系统发育分析
• 2.2.6 药物敏感实验
• 2.3 讨论
• 参考文献
• 3 注射灭活气单胞菌对刺参免疫指标的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 免疫指标的筛选
• 3.1.1.1 免疫刺激剂的制备及血清的制备
• 3.1.1.2 酚氧化酶（phenoloxidase, PO）活力的测定
• 3.1.1.3 超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定
• 3.1.1.4 酸性磷酸酶（ACP）与碱性磷酸酶（AKP）活力的测定
• 3.1.1.5 溶菌酶（Lysozyme）活力的测定
• 3.1.2 灭活气单胞菌的制备及安全性的检验
• 3.1.3 灭活气单胞菌对刺参免疫指标的影响
• 3.1.3.1 试验用参
• 3.1.3.2 血清的制备
• 3.1.3.3 酶活力测定
• 3.1.3.4 数据处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 免疫指标的筛选结果
• 3.2.2 灭活气单胞菌安全性的检验结果
• 3.2.3 注射灭活气单胞菌对刺参免疫指标测定的结果
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 4 总结和展望
• 4.1 本文的主要研究成果
• 4.2 本研究对养殖刺参疾病防治的作用和意义
• 4.3 本研究仍待解决的问题及今后的研究方向
• 4.4 刺参养殖期间疾病防治的建议
• 附录:常用试剂与配方
• 致谢