论文摘要
目的:恶性肿瘤是影响人类身心健康的重大问题,世界卫生组织发表的一项研究报告表明,全球癌症状况将日益严重,今后20年新发病人数将由目前的每年1000万增加到1500万,癌症死亡人数也将由每年600万增至1000万。癌症的发病机理十分复杂,机体在各种致癌因素（物理、化学、生理）的作用下,形成癌肿,其本质是一种基因病,也是一种分子病。正常细胞的癌变与多种基因的作用有关,根据这些基因在肿瘤发生和发展中的生物学行为,可分为肿瘤基因、肿瘤抑制基因、肿瘤转移基因和肿瘤转移抑制基因4大类。在这4类基因中,前后两对基因各自又形成一对既相互对立,又互相制约的两对性质各异,且具有正负调控作用的两大基因系统,从而维持着机体细胞的精细平衡。肿瘤相关基因在结构和功能上发生的异常,将导致肿瘤表达一些在质和量上异常的蛋白或多肽,也就是肿瘤抗原。肿瘤抗原分为肿瘤相关性抗原和肿瘤特异性抗原。近几年来,随着肿瘤抗原鉴定技术的发展,极大的促进了人们对肿瘤的认识和诊断治疗的发展。SC抗原（SCAg）是用人新鲜结肠癌实体瘤细胞免疫BALB/c小鼠制备的16种单克隆抗体所识别的一组肿瘤相关抗原。在胰腺、大肠、小肠、胃和乳腺等上皮性肿瘤组织中呈高表达,而在正常组织和胚胎组织中无表达或低表达。本实验使用免疫沉淀的方法纯化培养细胞的裂解物,获得了高纯度的肿瘤抗原SCAg3A, SCAg6。与用肿瘤组织裂解纯化抗原比较,可以免受组织成分的干扰,尤其是白蛋白。有了高纯度的肿瘤抗原以后就可以对抗原的氨基酸序列进行测定,进一步可以对肿瘤抗原基因进行分子克隆,从而获得大量的肿瘤抗原蛋白。对其性质和功能的深入研究,可以理解肿瘤抗原在肿瘤发生发展中的作用以及探讨肿瘤的免疫逃避机制等等。早期诊断是肿瘤治疗的关键,可以提高肿瘤的治愈率、降低死亡率。如果使用本实验的肿瘤抗原与传统的肿瘤抗原作为靶抗原进行联合诊断,可以提高相关肿瘤的诊断率。目前,以免疫学为基础的肿瘤疫苗在肿瘤预防和治疗领域的优势,使肿瘤疫苗成为当前生物学领域的一个研究热点。本文中的抗原纯化后可以直接制备成肿瘤疫苗或着将肿瘤抗原体外致敏树突状细胞（DC）作为疫苗,也可将编码肿瘤抗原的基因转入肿瘤细胞内,可以有效地提高瘤苗的免疫原性。用肿瘤抗原基因修饰DC等抗原递呈细胞更是一种值得重视的瘤苗设计方案。方法:腹水单克隆抗体SCAb3A和SCAb6由本研究所制备。肿瘤细胞系由本所保存及北京军事医学科学院惠赠,免疫沉淀试剂盒为美国Pierce公司产品。复苏液氮中冻存的肿瘤细胞,常规培养和传代。用辛酸法纯化腹水单克隆抗体并与免疫沉淀柱进行耦联。对所培养的大肠癌细胞系LS-180,Cola205,SW1116,肺癌细胞系A549和乳腺癌细胞系SK用免疫细胞化学染色法进行鉴定,选取阳性细胞系LS-180。刮取离心收集阳性细胞并用PBS离心洗涤3次,裂解液4℃裂解30min后又使用冰浴超声裂解10min,经透析后制备成粗提抗原,然后通过免疫沉淀进行分离、纯化。浓缩后以SDS-PAGE、Western blot和点杂交（Dot blot）对纯化抗原进行鉴定。结果:免疫细胞化学染色显示,SCAg3A及SCAg6蛋白在结肠癌细胞系LS-180中表达,主要位于细胞膜及细胞质中,在乳腺癌细胞系SK中呈低表达,在其它细胞系中无表达。经纯化后的SCAg3A和SCAg6,通过SDS-PAGE均显示一条带,其分子量分别约为60.1 kD和59.0 kD。Western blot与其相应抗SCAg单克隆抗体反应良好,点杂交检测结果与Western blot一致,并且发现SCAg3A和SCAg6之间无交叉反应。结论:本研究通过免疫沉淀等技术,成功地获取了两种高纯度的肿瘤相关抗原SCAg3A及SCAg6,证实了用培养的细胞系提取高纯度的肿瘤抗原SCAg3A和SCAg6是可行的,为恶性肿瘤的生物学研究和肿瘤疫苗的研制提供了物质基础,为攻克严重影响人类健康的恶性肿瘤开辟了新的道路。