斑蝥素提取、特异性抗体的制备及其酶联免疫检测方法的研究

论文摘要

斑蝥素（cantharidin）,是中药材斑蝥的有效成分,属于倍半萜烯类天然防御性毒素,由于其独特的抗癌性,人们在其抗癌机制以及毒理药理上进行了大量的研究,并合成了大量的斑蝥素衍生物。但是,仍然在斑蝥素的生物合成位点、合成途径已经斑蝥素的抗癌机制上存在许多疑难问题。目前,斑蝥素的检测方法有重量法、酸碱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法等,但这些方法通常需要昂贵的色谱仪器,有的还必须事先对样品进行繁杂的纯化处理,而且对操作人员的技术要求很高。然而,随着免疫学的发展,酶联免疫检测方法不再仅仅局限于大分子的检测,而是日益广泛的被用于小分子物质的检测。虽然小分子物资在结构上不具有抗原性,但是通过与大分子物质偶联后便具有了抗原的免疫原性和免疫反应性。进而,就可以构建小分子的酶免疫检测方法了。研究目的:从斑蝥体内提取斑蝥素,以此合成斑蝥素羧基衍生物N-羧乙基斑蝥酰亚胺,探究合成反应最佳条件及产率并比较二者的毒性;通过斑蝥素和β-丙氨酸合成半抗原N-羧乙基斑蝥酰亚胺,并借助半抗原的偶联来制备人工完全抗原,免疫兔子获得特异性抗体,最终根据抗原抗体反应原理建立斑蝥素间接竞争ELISA检测方法及其检测曲线。研究方法:以混合提取法、震荡提取法及快速提取法等方法分别提取斑蝥素,并进行比较;在单因素不同的体系中斑蝥素与β-丙氨酸进行缩合反应,且用GC、TLC、UV、MS、NMR等对提取物及反应产物进行鉴定,并通过改良寇氏法测定斑蝥素及其衍生物的LD50以比较其胃毒毒性;以NHS酯法用偶联剂DCC、NHS将半抗原N-羧乙基斑蝥酰亚胺偶联到载体蛋白上,用摩尔吸光系数法进行检测确认偶联成功后,用斑蝥素人工完全抗原免疫兔子;ELISA方法检测抗体效价达到1:3200后分离血清,并用CNBr活化的琼脂糖凝胶4B亲和层析对抗血清中的进行纯化,对于纯化的结果借用SDS-PAGE以及ELISA方法进行检测;将纯化的斑蝥素特异性抗体及斑蝥素人工完全抗原采用间接竞争法构建斑蝥素间接竞争ELISA检测方法,并建立检测曲线,探讨该检测曲线的检测范围及其极限,用GC法来验证蝥素间接竞争ELISA检测方法在检测斑蝥粗提物斑蝥素的含量中的准确性与可靠性。研究结果:混合提取法得到的斑蝥素纯度达98.53%,经结构鉴定可以确认缩合产物为N-羧乙基斑蝥酰亚胺;缩合反应的最佳反应条件:n（斑蝥素）/n（β-丙氨酸）=1/1.2;媒介溶剂与催化剂均为Et3N,最佳用量为1 mol的斑蝥素需72 ml的Et3N,125～150℃下脱水反应4～5 h,产率可达74.40%。衍生物对小鼠的胃毒性仅为斑蝥素毒性的1/400;经过鉴定,采取NHS酯法得到的人工完全抗原中半抗原N-羧乙基斑蝥酰亚胺与载体蛋白BSA、OVA的结合比分别为25:1、23:1;兔抗血清的效价在纯化之前为1:3200,纯化后达到1:6400～1:12800,为纯化前的2～4倍;斑蝥素间接接竞争ELISA检测方法及其测定曲线为y=-0.0697x+0.1894,该曲线的检测范围是2.4 mg/ml～2.4 mg/L,并且,在对斑蝥的粗提物进行斑蝥素含量的实际检测中,斑蝥素酶免疫测定方法与气相色谱法在统计学上无明显差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 斑蝥素资源及其生物合成
• 1.2.2 药理毒理机制及应用
• 1.2.3 斑蝥素的提取
• 1.2.4 斑蝥素的鉴定
• 1.2.5 斑蝥素及其衍生物的人工合成
• 1.2.6 小分子物质人工完全抗原的制备
• 1.2.7 ELISA 技术在小分子物质检测上的应用
• 1.3 气相色谱及其应用
• 1.4 紫外吸收及其应用
• 1.5 质谱及其应用
• 1.6 核磁共振及其应用
• 1.7 亲和层析及其应用
• 1.8 研究目的及意义
• 1.9 研究内容和技术路线
• 1.9.1 研究内容
• 1.9.2 技术路线
• 1.10 本研究的创新点
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.2 主要仪器
• 2.3 试剂
• 2.3.1 斑蝥素的提取所需试剂
• 2.3.2 斑蝥素结构修饰所需试剂
• 2.3.3 斑蝥素完全抗原的制备所需试剂
• 2.3.4 斑蝥素特异性抗体制备所需试剂
• 2.3.5 斑蝥素的酶联免疫方法构建所需试剂
• 2.4 方法
• 2.4.1 斑蝥素的提取及检测
• 2.4.2 半抗原N-羧乙基斑蝥酰亚胺的合成及其鉴定
• 2.4.3 N-羧乙基斑蝥酰亚胺及斑蝥素对小白鼠胃毒毒力的比较
• 2.4.4 斑蝥素完全抗原的制备与鉴定
• 2.4.5 斑蝥素特异性抗体的制备与纯化
• 2.4.6 斑蝥素的酶联免疫方法构建
• 3 结果与分析
• 3.1 斑蝥素的提取及检测
• 3.1.1 斑蝥素的提取
• 3.1.2 斑蝥素的鉴定
• 3.2 N-羧乙基斑蝥酰亚胺的鉴定
• 3.2.1 产物溶解性的鉴定
• 3.2.2 产物紫外波谱的鉴定
• 3.2.3 产物的TLC 鉴定
• 3.2.4 产物的MS 鉴定数据
• 3.2.5 产物的NMR 鉴定
• 3.3 影响缩合产物产率的主要因素
• 3.3.1 反应物的比例对产率的影响
• 3.3.2 不同媒介溶剂对产率的影响
• 3.3.3 脱水闭环反应的反应温度以及时间对产率的影响
• 3.3.4 催化剂 Et3N 用量对产率的影响
• 3.4 斑蝥素与N-羧乙基斑蝥酰亚胺毒性强弱比较
• 3.5 斑蝥素完全抗原的鉴定
• 3.6 兔抗血清效价鉴定
• 3.7 斑蝥素特异性抗体纯化结果
• 3.7.1 斑蝥素特异性抗体的亲和层析
• 3.7.2 斑蝥素特异性抗体纯化后的效价变化
• 3.7.3 纯化后的斑蝥素特异性抗体的纯度鉴定
• 3.8 斑蝥素的酶联免疫方法构建
• 3.8.1 斑蝥素酶免疫分析曲线及其检测极限
• 3.8.2 斑蝥素酶免疫分析方法可靠性分析
• 4 讨论
• 4.1 影响斑蝥素提取纯及其产率的因素
• 4.2 斑蝥素的气相色谱测定的影响因素
• 4.3 斑蝥素衍生物的合成路线选择
• 4.4 斑蝥素与N-羧乙基斑蝥酰亚胺的毒性区别及其意义
• 4.5 斑蝥素完全抗原对抗体的影响
• 4.6 亲和层析纯化结果的讨论
• 4.7 斑蝥素酶联免疫测定方法的关键点
• 5 结论与后续工作展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录