吕春林(大兴安岭地区加格达奇区疾病预防控制中心165000)
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)01-0119-02
【摘要】噬菌体在普通显微镜下看不到，在电子显微镜下有四种外形，即有尾(均有一立方对称的头及螺旋对称的尾)、立方体(无尾，衣壳为立方对称)、丝杆状(无头尾区别，呈螺旋对称)，和多形性(有包膜无衣壳)。大多数噬菌体由头部和尾部组成。例如大肠杆菌T4噬菌体头部呈六边形，立体对称，大小约95×65nm，内含遗传物质核酸；尾部是管状器官，长95～125nm，直径13～20nm，是由一个内径约2.5nm中空的尾髓和外面包着的尾鞘组成。尾髓具有收缩功能，可使头部核酸注入宿主菌。在头和尾连接处的颈部还有一个颈圈结构，颈圈有六根须。尾部末端有尾板、尾刺和尾丝。尾板内可能有使宿主菌细胞壁裂解的溶菌酶。尾丝为噬菌体的吸附器官，能识别宿主菌表面的特殊受体。
【关键词】噬菌体检验
一、噬菌体的分离
所有样品必须是液体。土壤和其它污物可悬于适量液体培养基中。为了易于分离，可以预先经过培养，使样品中的噬菌体数量增加，这一步称富集。其方法是将2～3g土样或5ml水放入灭菌三角瓶中，加入对数生长的敏感指示菌3～5ml，并补加培养基20～25ml，在适宜温度下振荡或静止培养过夜。如果样品中有噬菌体，将随细菌的生长繁殖而使噬菌体数量增多，因而达到富集目的。需要定量检查相对噬菌体时，应该省略上述操作，直接进行分离。将上述样品液以3000r／min离心或通过微孔滤膜(孔径0．45μm)除去杂菌。有的实验室采用氯仿消除杂菌，即在样品上清液中加入1／50～1／10体积氯仿，混合，涡动，保温1h后取上清液。这种方法仅对氯仿不敏感的噬菌体适用。取消除杂菌后的上清液用肉汤或缓冲液，经适当稀释后用双层或单层琼脂法检查。
二、溶原性细菌的检查
(一)自发释放噬菌体的菌株检查
许多细菌自发释放噬菌体，其频率为10-2～10-5。从溶原菌中分离噬菌体，首先必须排除由噬菌体本身所携带的游离噬菌体，其次是选择足够数量的相近菌株。测定所释放的噬菌体，关键是选择敏感指示菌，才能在指示菌的菌苔上形成噬斑而加以区别。缺适宜的指示菌就不能获得噬斑，也无法判断是否释放噬菌体和作出结论。
1．先在平板上挑选典型单菌落，在生理盐水制成悬液，振荡分散细胞，在3000r／min离心30min，弃去上清液，重悬在生理盐水中，离心洗涤三次，取沉淀物适当稀释后，涂布在平板上，获得单菌落，连续洗涤三次的目的是脱除所携带的噬菌体。
2．取上述处理的菌株培养物，按1％的接种量接入10ml培养基的三角瓶中，在适宜温度(因菌不同而不同)下振荡培养2．5～3h，或静止培养过夜14h。
3．取对数生长的敏感指示菌培养物0.2ml和稀释的上清液0.1ml混合。用双层或单层琼脂平板，铺展上述混合物。在适宜温度下培养。
4．凡出现噬斑的菌株，可证明该菌株是溶原性菌株；未出现噬斑的菌株：还不能确定为非溶原性菌株，可能需要寻找适当的指示菌，再经过测定才能得出正确结论。
(二)经诱导产生噬菌体的菌株检查
有些溶原菌以极低的频率产生噬菌体，而利用常规方法无法检测。如果利用紫外线或丝裂霉素C诱导，可明显提高噬菌体产生的几率。
紫外线诱导操作程序：
1．取对数生长的细菌悬液(5×108／ml)，经缓冲液洗涤，重悬在缓冲液中，配成108／ml。将5ml悬液放入带有一微型转子的直径9cm小皿中。
2．小皿放在电动搅拌器上，距离15W紫外线灯管30cm处，灯管应事先启动30min后再照射。
3．在蔽光下开动搅拌器进行照射，以5s，10s，20s，30s，40s，50s和60s计时照射。
4．取出4ml照射液，加入1ml5倍浓缩培养基混合。移入所需温度振荡培养数小时，遮光。
5．3000r／min离心30min沉降细胞碎片，取上清液，适当稀释，用双层或单层琼脂法在指示菌平板培养，观察噬斑。
6．凡有噬斑出现的菌株为溶原性菌株。
三、噬菌体的检测
现在普遍采用双层法进行噬菌体的检查和定量测定。事先分别配制含1.5％～2.0％和0.5％～1％琼脂(因琼脂质量不同可加减变化)的两种培养基。将2％琼脂培养基作底层，铺成平板待用。取0．2ml对数生长的菌悬液或用生理盐水也可用培养基洗下生长旺盛的细菌斜面，配制菌悬液和被测定的噬菌体液或待测样品液0．1ml，加入已融化冷却至45℃含有1％琼脂培养基3～4ml，于试管中混合，立即倒在平板上铺平凝固后，移入温箱培养。一般经过10～20h(有些噬菌体培养在37℃4～5h)，即可观察结果。如有噬菌体，在琼脂的上层出现透亮的圆形或近似圆形的空斑。这是噬菌体感染敏感细胞后，释放子代噬菌体，继续向附近正在生长的细菌侵染，通过几次连续侵染，在琼脂层不断往外扩展，逐渐形成抑制和裂解细菌的区域，在菌苔上即可看到透明的斑，即噬菌斑(plaque)。1个直径为0.5nnn的噬菌斑可能含有105～6个噬菌体颗粒。
噬斑是噬菌体的一种特性标志，在一定条件下相对稳定。但是随着宿主生理条件，年龄以及培养条件如琼脂的浓度、底层平板的厚度、培养温度和时间会影响斑的变化。噬菌斑的形态有的形成晕圈，有的形成多重同心圆斑，也有近似圆形。斑的大小差异悬殊，一般直径在0.1～2.0mm左右。在观察和判定噬斑时，往往与经验有关，可能在开始时会遇到不易判断的困难。在难于做出结论时，建议将可疑的斑挑出，在生理盐水中经适当稀释后再按双层琼脂法分析，可以得出可靠无误的结果。
另一种简易测定是单层法，即省略底层，而将含1％琼脂的培养基连同菌悬液和噬菌体液直接在平皿中铺成平板。此法较双层法简便省料。为了确切定量，常用双层法。
四、噬茵体的保存
大多数噬菌体在其增殖的培养基或肉汤中稳定。效价达到1010pfu／ml以上的原液才适宜保存。密封或用螺旋帽盖紧后，以石腊膜封闭保存在4℃(勿使结冰)。一般可保存数月至数年，随不同噬菌体而异。最好的办法是保存在－70℃，也可保存在液氮。
参考文献
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