抗H-Y抗原抗体的制备和成熟精子中Y染色体编码基因mRNA的研究

论文摘要

作为雄性生殖细胞的精子,其承担着将父亲的遗传物质传递给卵子的任务。长期以来,人们一直认为,精子传递给卵子的遗传物质仅仅包含父亲的基因组DNA。按照这种观点,精子作为一个终末分化的细胞,其除了高度压缩的染色体DNA和薄薄的一层胞质外,似乎没有转录和翻译的活性。然而随着分子生物学技术的不断进步,人们发现在精子中存在着大量而复杂的mRNA群体。通过基因芯片结合PCR的方法,人们在成熟精子中检测出大约3500-5000种的mRNA。我们实验室用基因序列分析（SAGE）的方法对人成熟精子中的mRNA进行了分析,结果也检测到了相同数量级的mRNA。并且我们对表达丰度较高的389个基因进行功能聚类性分析,发现成熟精子中保留的mRNA呈现出高度的选择性。这些mRNA中最多的是参与DNA依赖的基因转录和转录调节的基因以及核糖体亚单位相关基因,而从成熟精子表达基因的染色体分布来看,1号染色体的基因数目最多,而1号染色体又与男性不育相关,Y染色体数目最少。那么,为什么在一个终末分化的细胞中会保留如此众多的高选择性的mRNA,这些mRNA又执行怎样的功能呢?最初,这些mRNA被认为是体细胞的污染;或者是在精子形成过程中,发生了转录关闭,精子染色体上的组蛋白被鱼精蛋白所取代,精子中的mRNA可能是这些作用的“副产品”,属于被动地留下。然而直到最近,研究发现精子中的mRNA在受精过程中会传递给卵子,并且持续稳定地存在,从而推测其可能在受精和胚胎早期发育过程中具有重要的作用。此外,研究证实精子可以利用线粒体中的多核糖体进行新生蛋白的翻译,结合对精子中mRNA的功能聚类性分析结果,我们可以发现精子中的mRNA似乎并不仅仅是精子发生过程中的无功能的残留物,而是有可能在精子发生过程中选择性地被保留下来,它们可能会在成熟精子中翻译新生蛋白以替换降解的蛋白或者产生新的蛋白用于精子的获能;另一方面,这些mRNA也可能在受精和胚胎早期发育过程中发挥作用。为了探究成熟精子中mRNA被选择性保留的机制,我们以Y染色体非重组区基因作为研究对象,对保留在人和小鼠成熟精子中的mRNA的功能和分布进行了深入分析和研究。本研究可以分为2部分工作:第一部分工作,由于H-Y抗原是本研究中主要的研究对象之一,而目前还没有商品化的针对H-Y抗原的抗体,我们首先要获得其特异性的抗体。研究证实,SMCY基因编码H-Y抗原,而由于H-Y抗原是一个弱抗原,并且H-Y抗原的序列在哺乳动物之间高度保守,使普通的免疫学方法无法获得高效价高特异性的抗体。那么为了获得高特异性的针对H-Y抗原的抗体,我们首先克隆了编码H-Y抗原的SMCY基因的3个片段,这3个片段中包含了编码H-Y抗原的4个主要抗原决定簇的DNA序列。然后我们运用分子生物学的方法将其连接在一起,形成一个新的只编码这4个主要抗原决定簇的SMCY基因重组体,从而大大提高了H-Y抗原的免疫原性。随后我们将SMCY重组体亚克隆到表达载体Pet-28（a）并转化入原核细胞BL21中诱导表达。表达后的融合蛋白利用其上的组氨酸标签通过镍柱进行纯化,将纯化后的H-Y抗原重组体蛋白免疫圈养鸡,从鸡蛋蛋黄中提取得到针对H-Y抗原的特异性的IgY抗体。所获得的IgY抗体再利用亲和层析的方法进行进一步的纯化,去除掉其中的杂蛋白和非特异性的抗体,最终获得了纯度高达99%以上的高亲和力高特异性的抗H-Y的IgY抗体。通过免疫凝胶扩散试验和免疫组化试验,结果显示此抗体可以与H-Y重组体蛋白和雄性细胞表面的H-Y抗原特异性的结合,其可以用于后续研究工作当中。第二部分工作,我们通过研究Y染色体编码基因mRNA在人和小鼠成熟精子当中的保留机制,揭示了精子mRNA对胚胎早期发育的影响和作用。我们首先通过RT-PCR对人和小鼠成熟精子中Y染色体非重组区的一系列基因进行了分析,结果发现在人成熟精子中可以检测到DBY （DEAD （Asp-Glu-Ala-Asp） box polypeptide 3, Y-linked）,SRY （sex determining region Y）和RPS4Y （ribosomal protein S4, Y-linked）这3个基因的mRNA,而在小鼠的成熟精子中只检测到了DBY的mRNA。随后我们对这些成熟精子中保留的基因与另外一个功能与它们截然相反的SMCY基因在人和小鼠中进行了对比分析。我们通过原位杂交的方法比较了这些基因的mRNA在人和小鼠的睾丸和成熟精子中的分布情况,结果显示DBY、RPS4Y和SMCY的mRNA都存在于人睾丸组织当中,而只有DBY和RPS4Y的mRNA存在于人约半数成熟精子的顶体后膜。同样,DBY和SMCY的mRNA也存在于小鼠睾丸组织中,而只有DBY的mRNA存在于小鼠半数精子的顶体后膜。随后我们又用Western Blot和免疫组化的方法分析了它们在人和小鼠睾丸和成熟精子中的表达状况。我们发现,与mRNA的状况截然相反,DBY和RPS4Y的蛋白只在人睾丸组织中检测到,而在人成熟精子当中没有检测到;而由SMCY编码的H-Y抗原在人睾丸和成熟精子当中都可以检测到。同样,DBY的蛋白只在小鼠睾丸组织中检测到,而在小鼠成熟精子当中没有检测到;而由SMCY编码的H-Y抗原在小鼠睾丸和成熟精子当中都检测得到。通过分析这些基因的功能,我们发现它们都可能参与受精和胚胎的早期发育过程,由于DBY参与DNA复制和转录起始,它在受精和胚胎早期发育过程中具有重要作用;而SRY作为性别决定因子,可能在早期的性别分化方面具有重要作用;RPS4Y编码核糖体蛋白S4,它可能在胚胎发育早期的蛋白合成中具有重要作用。最后,我们将DBY和SMCY的反义寡核苷酸显微注射入小鼠受精卵的雌雄原核当中,观察它们对小鼠受精卵发育的影响。结果发现DBY的反义RNA可以显著地抑制雄性小鼠受精卵的发育,而SMCY的反义RNA则对小鼠受精卵的发育没有影响。从而证实了精子mRNA在胚胎早期发育过程中具有重要的作用。综合以上工作,我们可以得到以下初步结论:（1）通过克隆H-Y抗原的4主要抗原决定簇形成新的重组体蛋白,并且免疫鸡提取卵黄抗体,我们得到了针对H-Y抗原的特异性的IgY抗体。（2）证实了在精子发育成熟的过程中,Y染色体基因的mRNA被选择性地保留在成熟精子当中。在人的成熟精子中,DBY,SRY和RPS4Y的mRNA被保留下来,而在小鼠的成熟精子中只有DBY被保留。这些Y染色体基因的mRNA都可能参与胚胎的早期发育过程。（3）SMCY的mRNA在编码完H-Y抗原后就被丢弃了,其可能是在精子完成变形以后才消失的。（4）我们每个人绝不仅仅从父亲那里遗传了基因组的信息,精子中携带的mRNA对胚胎的早期发育也发挥着重要的指导作用。实际上,合子形成和胚胎的发育准备工作可能是在精子开始发生的那一刻就启动了。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩略词表
• 第一章 成熟精子中mRNA 的研究现状
• 1. 精子发生的生理学过程
• 1.1 精子发生（spermatogenesis）
• 1.2 精子的结构
• 1.3 精子发生过程中的基因表达与调控
• 2. 关于精子中m RNA 的研究
• 2.1 精子mRNA 存在的证据
• 2.2 关于精子中RNA 存在的争议
• 2.3 成熟精子中mRNA 的种类和特征
• 2.4 精子中mRNA 的可能功能
• 3. 精子中蛋白质的合成
• 3.1 精子线粒体
• 3.2 mRNA 导向至线粒体
• 3.3 RNA 进入线粒体
• 3.4 线粒体rRNA 在细胞中的定位
• 3.5 哺乳动物精子中细胞核mRNA 在线粒体核糖体上翻译的证据
• 3.6 在精子中蛋白质合成的两种可能机制
• 第二章 H-Y 抗原重组体的克隆和表达及抗H-Y 抗原抗体的制备
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 试剂盒
• 2.1.3 菌株和质粒
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 常用试剂
• 2.1.6 常用试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SMCY 基因重组体的克隆及鉴定的方法与步骤
• 2.2.2 构建原核表达重组质粒pET-28a-SMCY
• 2.2.3 SMCY 重组融合蛋白的诱导表达及纯化
• 2.2.4 针对SMCY 基因重组体的多克隆IGY 抗体的获取，纯化及鉴定
• 3. 结果
• 3.1 SMCY 基因重组片段的选取
• 3.2 人和小鼠SMCY 与SMCX 表达蛋白氨基酸序列的对比分析
• 3.3 SMCY 基因的三个片段的RT-PCR
• 3.4 三个克隆片段质粒的酶切鉴定
• 3.5 重组质粒pET-28a-SMCY 的PCR 鉴定
• 3.6 H-Y 重组融合蛋白的表达
• 3.7 SMCY 重组融合蛋白的纯化
• 3.8 抗H-Y 抗原IgY 抗体的纯化
• 3.9 抗H-Y 抗原IgY 抗体的免疫扩散结果
• 3.10 抗H-Y 抗原IgY 抗体对人和小鼠雌雄细胞的免疫组化结果
• 4. 讨论
• 第三章 Y 染色体mRNA 在成熟精子中选择性保留机制的研究
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 组织标本与试验动物
• 2.1.2 试剂盒
• 2.1.3 菌株和质粒
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 常用试剂
• 2.1.6 常用试剂的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 精子的纯化
• 2.2.2 精子及组织RNA 的提取
• 2.2.3 RT-PCR
• 2.2.4 原位杂交:
• 2.2.5 Western 免疫印迹
• 2.2.6 免疫组化
• 2.2.7 精子细胞的间接免疫荧光
• 2.2.8 DBY 与SMCY 反义寡核苷酸表达载体的构建
• 2.2.9 反义寡核苷酸载体的小鼠受精卵的显微注射
• 2.2.10 小鼠胚胎的性别鉴定
• 3. 结果
• 3.1 精子的质量问题
• 3.2 Y 染色体编码的基因在人和小鼠不同组织中表达情况的PCR 结果
• 3.3 Y 染色体基因mRNA 在人与小鼠成熟精子和睾丸组织中的原位杂交结果
• 3.4 DBY 和RP54Y 在睾丸和成熟精子中的表达情况
• 3.5 SMCY 在睾丸和成熟精子中的表达情况
• 3.6 DBY 和SMCY 的mRNA 在受精卵中的存在情况
• 3.7 DBY 和SMCY 反义寡核苷酸载体的酶切鉴定
• 3.8 DBY 和SMCY 反义寡核苷酸显微注射的结果
• 3.9 显微注射后小鼠胚胎DBY 水平的检测
• 4. 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 附录 专利
• 发表论文
• 上海交通大学学位论文答辩决议书