荒漠地区优势地衣石果衣Endocarpon pusillum Hedwing全长cDNA文库的构建与初步分析

论文摘要

地衣作为一种特殊的菌藻共生复合生物或共生联合体,也被视为有控制地寄生于藻类或蓝细菌上的真菌,即地衣型真菌,它能适应低温、干旱等恶劣的生存环境。从严寒的南北两极到酷热的赤道,从高山到平原,从潮湿的土壤到干旱的沙漠,在其它植物不能生长的地方,常常可以找到地衣。本研究面向干旱沙漠治理的国家需求,围绕干旱沙漠生物地毯工程的基础研究,从地衣中筛选抗旱基因以创造抗旱转基因植物提供基因资源和技术储备,以沙坡头地区地衣优势种石果衣（Endocarpon pusillum Hedwing）中分离的共生菌为材料,从中进行抗旱基因筛选及其功能分析,主要进行了以下的研究:（1）率先构建了国内外第一个地衣型真菌的全长cDNA文库,其文库的滴度为1.5×106cfu/mL,重组率为95.5%。根据文库小规模测序结果,筛选出111个全长基因序列。这些序列在地衣型真菌中为国内外首次报道,BLAST结果显示42个CDS序列与非地衣型真菌有关基因的同源性大于75%;30个CDS序列与非地衣型真菌基因的同源性为60% -74%;28个CDS序列与非地衣型真菌基因的同源性小于60%,而11个CDS序列未发现与非地衣型真菌有同源性。由此可以推测,这些基因可能为地衣型真菌所特有,与地衣型真菌与藻类共生相关,或者在干旱荒漠地衣生命活动中起重要作用。（2）利用绝对定量PCR方法计算石果衣共生菌基因组的大小。从文库中挑选15个基因进行测定,选择其中10个扩增效率接近理论值的基因结果作为计算数据,最后得出共生菌的基因组大小的平均值为39.13Mb。（3）利用相对定量PCR方法计算rRNA基因重复单位的数目。选择3个基因（SCD, ATA, RPB11a）作为相对定量的参照基因。通过BLAST比对得知这三个基因在非地衣型真菌中为单拷贝基因。最后,计算出重复单位数目的平均值为43。（4）构建含有原肌球蛋白（Tropomyosin-1）编码全长cDNA的重组载体,然后转化入E. coli BL21中,经IPTG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化。这将有利于以后对地衣型真菌蛋白的研究。全长文库的构建有利于地衣型真菌抗性基因和新基因筛选工作的开展。基因组大小和rRNA基因的重复单位的测定,为全基因组测序工作奠定了基础。本研究填补了地衣分子生物学知识的空白。

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摘要

Abstract

1 绪论

1.1 前言

1.2 地衣的抗旱特性

1.2.1 干旱对地衣的影响

1.2.2 地衣的抗旱机制

1.3 其它真菌和植物抗旱基因的研究进展

1.3.1 具有渗透调节作用的基因

1.3.2 具有抗氧化胁迫作用的酶类

1.3.3 保护生物大分子及膜结构的相关基因

1.4 地衣分子生物学研究进展

1.4.1 筛选地衣中抗性基因的几种方法

1.4.2 全长cDNA 文库的意义和技术

1.5 真菌基因组学的研究进展

1.5.1 绝对定量PCR 方法测定地衣型真菌基因组大小的原理及意义

1.5.2 相对定量PCR 方法测定基因拷贝数的原理及意义

1.6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料及试剂

2.1.1 地衣材料

2.1.2 质粒载体及菌种

2.1.3 酶及化学试剂

2.1.4 培养基及试剂

2.1.5 PCR 引物

2.2 实验方法

2.2.1 CTAB 法提取地衣型真菌基因组DNA

2.2.2 PCR 扩增核糖体18S rRNA 序列验证提出的DNA

2.2.3 地衣型真菌总RNA 的提取

2.3 全长cDNA 文库的构建过程

2.3.1 cDNA 第一链的合成

2.3.2 LD-PCR 合成第二链cDNA 并扩增全长cDNA 双链

2.3.3 蛋白酶K 消化

2.3.4 限制性内切酶Sfi I 酶切

2.3.5 cDNA 大小分级

2.3.6 ds cDNA 连接载体pDNR-LIB

2.3.7 重组质粒电转化E.coli 中

2.3.8 原始文库质量鉴定

2.3.9 菌液PCR 检测

2.3.10 原始文库的扩增

2.3.11 全长cDNA 文库的初步筛选

2.5 相对定量PCR 测定rRNA 基因的拷贝数

2.6 原肌球蛋白（Tropomyosin-1）的表达及纯化

2.6.1 原肌球蛋白TPM-1 全长基因的获得

2.6.2 质粒DNA 的提取（按照Omega 质粒提取试剂盒说明）

2.6.3 表达载体的酶切

2.6.4 凝胶回收DNA 片段（参照Omgea 试剂盒说明书）

2.6.5 DNA 片段与克隆载体的连接

2.6.6 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.6.7 大肠杆菌BL21 热激转化

2.6.8 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测

2.6.9 IPTG 诱导蛋白浓度的测定

2.6.10 蛋白质可溶性表达检测

2.6.11 可溶性蛋白TPM-1 的分离纯化—金属螯合纯化

2.6.12 可溶性蛋白TPM-1 的分离纯化—分子筛层析

3 结果与分析

3.1 地衣型真菌Endocarpon pusillum 总RNA 的提取

3.2 双链cDNA 的合成

3.3 cDNA 的分级分离及检测

3.4 文库的初步鉴定

3.5 绝对定量PCR 计算基因组大小的结果

3.6 相对定量PCR 测定rRNA 基因的重复单位

3.7 原肌球蛋白（Tropomyosin-1）的序列分析

3.8 IPTG 诱导蛋白浓度的测定

3.9 蛋白可溶表达检测

3.10 可溶蛋白TPM-1 的分离纯化

4 讨论

4.1 RNA 提取方法的比较

4.2 cDNA 文库的构建

4.3 准确定量模板浓度在荧光定量PCR 中的重要性

4.4 绝对定量PCR 方法测定基因组大小

4.5 相对定量PCR 方法测定rRNA 基因的拷贝数

4.6 地衣型真菌的蛋白在E.coli 中的表达

5 结论

参考文献

附录

致谢

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