论文摘要
原发性肝癌（主要是肝细胞肝癌,hepatocellular carcinoma,HCC）是世界第三位癌症杀手,在中国更高居第二位。手术切除仍是肝癌最有效的疗法,但由于肝癌的多灶性、血管侵犯、合并肝硬化等,只有不到20%的患者就诊时适合手术治疗。1996年Rossi等报道应用射频消融（Radiofrequency ablation,RFA）治疗肝癌后,被迅速普及应用。随机对照研究表明对于直径≤5cm的HCC,射频消融可达到和手术切除相近的长期生存率。但射频消融肝癌后存在肿瘤残留问题,复发率较高,文献报道,残癌发生率为3%-52%,复发率达53%-81%。从而提出了许多问题:射频消融和手术相比哪一个会促进残余肿瘤播散转移,出于何种机制,如何联合治疗以提高射频疗效,等等。本课题即为此而设计,主要应用我所建立的转移性人肝癌MHCC97L裸鼠模型,模拟姑息性射频消融,主要目的是观察射频消融后残余肝癌的侵袭转移潜能的变化,和姑息性切除进行比较,探索联合用药提高射频消融疗效,还应用人侵袭转移相关基因芯片（Oligo Tumor MetastasisMicroarry,Super Array）筛选差异表达基因并进行实时荧光定量（Real-time PCR）验证。实验发现射频消融后残余肝癌的转移能力降低,其基因表达改变是一个动态过程,与MET表达降低,CDKN2A、FAT、COL4A2、TIMP2表达增加有关;姑息性切除后残癌的转移能力升高,可能与MMP-9、MMP-10、MTA2表达增加有关;还发现射频消融后联合应用绿脓杆菌制剂（Pseudomonas aeruginosa vaccine,简称PA）可抑制残癌生长、转移并延长生存期;和对照组相比,射频消融后联合应用PA残癌组织中HGF表达显著降低,KAI1表达显著增强。从而为进一步提高肝癌射频消融疗效提供了线索。一体外加热对肝癌细胞转移特性（侵袭）的影响42℃水浴加热MHCC97L细胞30min×2,对照组除不接受加热外,其他处理相同并在同一时间点观察。与对照组相比,42℃水浴加热促进MHCC97L细胞增殖（P＜0.01）,最大效应在加热后48h,增殖抑制率达-27.9%,细胞倍增时间缩短了15%;细胞克隆形成率先降低后升高（9.73±0.29 Vs 8.87±0.59,9.37±0.26 Vs 11.9±0.70）（P＜0.01）;流式细胞仪（FCM）检测细胞周期的变化,结果显示:42℃水浴加热后48h和96h的G1期细胞比例降低,S+G2期细胞比例增加（P＜0.01和P＜0.05）。42℃加热后48h和96h相同数量的细胞穿过人工基底膜到达Transwell小室膜背面的细胞平均数（侵袭实验）和穿过Transwell小室膜到达背面的MHCC97L细胞平均数（运动实验）均明显低于对照组（p＜0.01和P＜0.05）;提示水浴加热可以明显抑制人肝癌MHCC97L细胞的侵袭和运动能力。ELISA法检测相同数量细胞的上清液发现,42℃加热抑制人肝癌MHCC97L细胞VEGF和MMP-2蛋白的分泌,最大抑制率分别达37.5%（48h）和43.7%（72h）,和MHCC97L细胞的侵袭和运动能力降低的趋势是一致的。本研究提示,体外加热（42℃）虽然有促进肝癌细胞生长和增殖的作用,但抑制体外侵袭性,其作用和MMP-2、VEGF表达降低有关。二射频消融对肝癌转移特性影响的体内研究1射频消融后肝癌转移特性的改变:和对照组比较,1周和4周为了在体内研究射频消融后残余肝癌转移能力的变化,我们将具有肺转移潜能的人MHCC97L肝癌组织块种植于BALB/c nu/nu雄性裸鼠肝脏,建立转移性人肝癌裸鼠原位模型。待种植后30d瘤体直径1cm左右时进行射频消融,对照组行假手术。分别于射频消融后1周和4周处死射频组及其对照组裸鼠,观察肿瘤体积、肺转移率、肺转移灶数目;并切除残癌和对照组肝癌组织再次原位种植于正常裸鼠肝脏,6周后处死,观察肿瘤体积、肺转移率、肺转移灶数目。结果显示,裸鼠射频消融后1周和4周组肿瘤体积和其对照组相比差异均无统计学意义（1450±460mm3 Vs 1570±380mm3,1540±930mm3 Vs 2290±430mm3）（P＞0.05）;裸鼠射频消融后4周组裸鼠的肺转移率和其对照组相比无明显差异[85.7%（6/7）Vs 85.7%（6/7）]（P＞0.05）;但肺转移灶个数明显低于其对照组（9.86±7.43 Vs 23.57±14.26）（P＜0.05）。和其对照组肝癌切除后再种植于裸鼠肝脏6周后相比,射频消融1周后残癌切除后再种植于裸鼠肝脏6周后肿瘤大小明显降低（1240±440mm3 Vs 30±30mm3）（P＜0.05）,肺转移率和肺转移灶个数也有降低趋势[40%（2/5）Vs 0（0/5）和0.8±1.3 Vs 0]但无统计学意义（p＞0.05）。和其对照组肝癌切除后再种植于裸鼠肝脏6周后相比,射频消融4周后的残癌切除后再种植于裸鼠肝脏6周后肿瘤体积无明显差异（720±510mm3 Vs 800±270mm3）（P＞0.05）,肺转移率有降低趋势[57.1%（4/7）Vs 28.6%（2/7）]但无统计学意义（p＞0.05）;肺转移灶个数明显降低（10.29±0.49 Vs 2.00±1.9）（P＜0.05）。人侵袭转移相关基因芯片及Real-time PCR显示,射频消融后1周残癌组织中具有促进转移作用的基因MET的mRNA表达显著降低,而射频消融后4周残癌组织中具有抑制肿瘤转移作用的基因CDKN2A、FAT mRNA表达显著升高（P＜0.05）;其变化趋势和射频消融后残余肝癌的转移能力降低的结果是一致的。本研究提示,和对照组比较,射频消融后近期残余肝癌的转移能力是降低的,其作用分别和MET、CDKN2A、FAT的差异表达有关。2射频消融和姑息性手术比较:6周为了在体内进一步验证射频消融后远期残余肝癌侵袭转移能力的变化并和姑息性切除进行比较,模型同上,待种植后30d瘤体直径1cm左右时分别进行射频消融和姑息性切除,单纯对照组行假手术。治疗后6周处死三组裸鼠,观察肿瘤体积、肺转移率、肺转移灶数目;并切除射频消融和姑息性切除组残癌和对照组肝癌组织再次原位种植于正常裸鼠肝脏,6周后处死,观察肿瘤体积、肺转移率、肺转移灶数目。结果显示,射频消融6周后的裸鼠肿瘤体积与对照组相比无显著差异（3340±970mm3 Vs 2430±380mm3）（P＞0.05）;肺转移率和对照组无差异[均为100%（6/6）];肺转移灶个数明显低于对照组（9.17±5.64 Vs 18.00±7.54）（P＜0.05）;姑息性切除后6周的裸鼠肿瘤体积明显高于对照组（3640±1240mm3Vs 2430+380mm3）（P＜0.05）;肺转移率和对照组无差异[均为100%（6/6）];肺转移灶个数明显高于对照组（30.33±7.40 Vs 18.00±7.54）（P＜0.05）。和对照组肝癌切除后再种植于裸鼠肝脏6周后相比,射频消融6周后残癌再种植于裸鼠肝脏6周后,其肿瘤体积无显著差异（2800±1000mm3 Vs 2200±830mm3）（P＞0.05）,肺转移率降低有降低趋势[83.3%（5/6） Vs 50.0%（3/6）],但没有统计学意义（P＞0.05）,肺转移灶个数明显降低（4.2±3.3 Vs 0.8±1.1）（p＜0.05）。和对照组肝癌切除后再种植于裸鼠肝脏6周后相比,姑息性手术6周后残癌再种植于裸鼠肝脏6周后,其肿瘤体积无显著差异（2800±1000mm3Vs2100±720mm3）（P＞0.05）,肺转移率有升高趋势[83.3%（5/6） Vs 100%（6/6）]但差异没有统计学意义（p＞0.05）,肺转移灶个数明显升高（4.2±3.3 Vs 10.2±4.3）（P＜0.05）。人侵袭转移相关基因芯片及Real-time PCR显示,与对照组相比,射频消融6周后的残癌组织中具有抑制肿瘤转移作用的基因COL4A2、TIMP2的mRNA表达显著升高（P＜0.05）,姑息性切除6周后的残癌组织中具有促进肿瘤转移作用的基因MMP-9、MMP-10、MTA2的mRNA表达显著升高（P＜0.05）;其变化趋势和射频消融后残余肝癌的转移能力降低、姑息性切除后残余肝癌的转移能力升高的结果是一致的。对裸鼠肝癌模型的生存期观察发现,从射频消融和姑息性手术时算起,姑息性射频组、姑息性切除组和对照组分别为61d±5d、65d±8d和57d±6d,差异均无统计学意义（P＞0.05）。提示无论是姑息性射频消融组还是姑息性切除组比均不能显著延长荷瘤裸鼠生存期。本研究提示,射频消融后远期残余肝癌的转移能力有所降低,而姑息性切除后远期残余肝癌的转移能力则有所升高。其作用分别与COL4A2、TIMP2和MMP-9、MMP-10、MTA2的差异表达有关。三吲哚美辛（消炎痛）和绿脓杆菌制剂（PA）提高射频消融疗效的研究1吲哚美辛和PA均可抑制肝癌细胞体外增殖和侵袭运动能力分别应用不同浓度的吲哚美辛和绿脓杆菌制剂作用于MHCC97L细胞,对照组除不加药外,其他处理相同并在同一时间点观察。结果发现,吲哚美辛明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈明显的剂量.效应关系。吲哚美辛浓度为0.1、0.2mM时,细胞倍增时间分别为110.1h、199.3h,与对照组（58.6h）相比均明显延长,而0.5mM吲哚美辛处理组第6天的细胞均数[（3.4±0.4）×104/mL]少于初始细胞数（4×104/mL）;吲哚美辛浓度为0.1、0.2、0.5mM时,克隆形成率依次降低（4.92%±0.79%、2.42%±0.60%、0.00%±0.00%Vs 10.65%±0.74%）（P＜0.01）;FCM显示,G1期细胞比例随吲哚美辛浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随吲哚美辛浓度增加而降低（P＜0.01）;提示其抑制作用和导致细胞G1期阻滞有关。吲哚美辛（0.2mM）处理后72h的相同数量细胞穿过人工基底膜（侵袭实验）和上室底膜（运动实验）的细胞数（分别为2.2±1.3和4.4±1.1）明显低于对照组（11.4±1.9和12.8±1.8）（P＜0.01）;ELISA法检测相同数量细胞的上清液发现,0.2mM吲哚美辛组VEGF蛋白浓度明显低于对照组:（607.8±22.8）pg/ml Vs（869.2±8.6）pg/ml（P＜0.01）;0.2mmM吲哚美辛组MMP2蛋白浓度（稀释200倍）明显低于对照组:（46.6±4.1）pg/ml Vs（76.1±4.2）pg/ml（p＜0.01）,提示吲哚美辛可明显抑制人肝癌MHCC97L细胞的侵袭和运动能力,其作用和抑制VEGF和MMP-2蛋白分泌有关。PA明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈明显的剂量-效应关系。PA48 h和72 h的IC50分别为3.1×108/ml和1.9×108/ml。PA浓度为0.5×108/ml、1×108/ml和2×108/ml时,其细胞倍增时间依次延长,克隆形成率依次降低（P＜0.01）;FCM显示,G1期细胞比例随PA浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随PA浓度增加而降低（P＜0.01）,;提示其抑制作用和导致细胞G1期阻滞有关。PA（1×108/ml）处理后72h的相同数量细胞穿过人工基底膜（侵袭实验）和上室底膜（运动实验）的细胞数（分别为4.8±1.3和8.8±2.2）明显低于对照组（8.6±2.1和15.6±1.2）（P＜0.01）;ELISA法检测相同数量细胞的上清液发现,1×108/ml的PA组其VEGF蛋白和MMP-2蛋白含量和对照组相比均无明显差异（p＞0.05）,提示PA可明显抑制人肝癌MHCC97L细胞的侵袭和运动能力,其作用和VEGF、MMP2蛋白分泌关系不明显。2吲哚美辛和PA抑制肝癌在裸鼠体内生长转移的研究为了在体内进一步验证吲哚美辛和PA对肝癌生长转移能力的抑制作用,模型同上,分为对照组、吲哚美辛组（3mg/kg·d）、PA组（4.4×108/d）和小剂量吲哚美辛（1.5mg/kg·d）+小剂量PA组（2.2×108/d）,种植后48h开始用药,连续用药40d,对照组除不用药外,其他处理相同。结果显示,PA组和小剂量吲哚美辛+PA组的肿瘤体积明显小于对照组,抑瘤率分别为36.7%和62.2%（P＜0.05和P＜0.01）,PA组和小剂量吲哚美辛+PA组肺转移率均为0,均明显低于对照组[66.7%（4/6）]（P＜0.05）。吲哚美辛组肿瘤体积、肺转移率、肺转移灶个数与对照组相比均有降低趋势[1130±610mm3 Vs 1670±370 mm3,50%（3/6）Vs 66.7%（4/6）,1.75±0.71 Vs 2.34±0.95],但差异均无统计学意义（P＞0.05）。免疫组织化学染色检测显示,和对照组相比,PA组肝癌组织COX-2蛋白的表达略有降低。小剂量吲哚美辛+PA组肝癌组织COX-2蛋白表达明显降低。提示PA尤其是联合应用小剂量吲哚美辛和小剂量PA可显著抑制肝癌在裸鼠体内的生长转移,并可能与COX-2下调有关。3吲哚美辛和PA均能抑制体外加热后肝癌细胞的增殖,进一步抑制其侵袭运动能力42℃水浴加热前2h分别加入0.2mM吲哚美辛和1×108/ml PA,加热组不加药,对照组不加热、不加药,其他处理相同并在同一时间点观察。与对照组相比,42℃水浴加热前分别加入0.2mM吲哚美辛和1×108/ml PA均能明显抑制人肝癌MHCC97L细胞的增殖（P＜0.01）,其最大抑制效应均为加热后48h,分别达到53.6%和42.3%,细胞倍增时间分别延长了2.07倍和1.68倍;42℃水浴加热前分别加入0.2mM吲哚美辛和1×108/ml PA后48h、96h的细胞集落形成率均明显降低（P＜0.01）;FCM显示,42℃水浴加热前2h分别加入0.2mmol/L吲哚美辛和1×108/ml PA均能逆转加热对细胞周期的影响,抑制细胞进入DNA合成期和分裂期,提示其抑制作用和导致细胞G1期阻滞有关。42℃水浴加热前2h分别加入0.2mmol/L吲哚美辛和1×108/ml PA,其加热后48h和96h相同数量的细胞穿过人工基底膜到达Transwell小室膜背面的细胞平均数（侵袭实验）和穿过Transwell小室膜到达背面的MHCC97L细胞平均数（运动实验）均明显低于加热组（P＜0.01）;ELISA法检测相同数量细胞的上清液发现,42℃水浴加热前2h加入0.2mM吲哚美辛能够进一步抑制VEGF和MMP-2蛋白的分泌,其加热后96h的分泌量均明显低于加热组（P＜0.01）;42℃水浴加热前2h分别加入1×108/ml PA没有这种效应,其加热后96h细胞VEGF和MMP-2蛋白的分泌量和加热组相比差异没有统计学意义（p＞0.05）。提示吲哚美辛进一步抑制体外加热后肝癌细胞侵袭运动能力和抑制VEGF和MMP-2的表达有关,PA也可进一步抑制肝癌细胞的侵袭和运动能力,其作用和VEGF、MMP2的表达无关。4射频后联合使用PA能进一步抑制残余肝癌在裸鼠体内的生长转移并延长生存期为了探索联合用药提高射频疗效并验证体外实验的结果,模型和射频消融方法同上,分为对照组、射频组、射频+吲哚美辛组（3mg/kg·d）和射频+PA组（2.2×108/d）。射频消融后开始用药,连续用药40天,6周后处死裸鼠,观察肿瘤体积、肺转移率、肺转移灶数目;并切除残癌和对照组肝癌组织再次原位种植于正常裸鼠肝脏,6周后处死,观察肿瘤体积、肺转移率、肺转移灶数目。结果显示,和射频组相比,射频+吲哚美辛治疗6周后的肿瘤体积、肺转移率、肺转移灶个数均无显著差异[3340±970mm3 Vs 3730±840mm3,100%（6/6）Vs83.3%（5/6）,9.17±5.64 Vs 13.83±15.72]（P＞0.05）;射频+PA治疗6周后肿瘤体积明显减小（3340±970mm3 Vs 1940±450mm3）（P=0.01）,肺转移率有降低趋势[100%（6/6） Vs 50.0%（3/6）],但无统计学差异（P＞0.05）;肺转移灶个数明显降低（9.17±5.64 Vs 2.83±3.49）（P＜0.05）。和射频消融6周后残余肝癌再种植于裸鼠肝脏6周后相比,射频+吲哚美辛治疗6周后残余肝癌再种植于裸鼠肝脏6周,其肿瘤大小、肺转移率和肺转移灶个数组均无显著差异[2200±830mm3 Vs 2010±430mm3,50.0%（3/6） Vs 50.0%（3/6）,0.8±1.2 Vs 0.7±0.8]（P＞0.05）;射频+PA组治疗后6周残余肝癌再种植于裸鼠肝脏6周,其肿瘤体积无显著差异（2200±830mm3 Vs 1800±140mm3）（P＞0.05）,肺转移率有降低趋势[50.0%（3/6） Vs 0（0/6）]（P＞0.05）,肺转移灶个数明显降低（0.8±1.2 Vs 0）（P＜0.05）。说明射频后联合应用PA可以进一步抑制残癌生长转移。人侵袭转移相关基因芯片及Real-time PCR显示,射频+PA治疗6周后残余肝癌组织中具有促进转移作用的基因HGF的mRNA表达显著降低,而具有抑制肿瘤转移作用的基因KAI1的mRNA表达显著增强;其变化趋势和PA进一步抑制射频消融后残余肝癌的转移能力的结果是一致的。从射频消融和姑息性手术时算起,生存期观察显示,射频+PA组（86d±10d）和对照组（57d±6d）、射频组（61d±5d）比较,生存期均明显延长（P＜0.05）,射频+吲哚美辛组（50d±3d）和对照组（57d±6d）、射频组（61d±5d）比较,生存期无显著差异（p＞0.05）。结论1.和对照组相比,射频治疗后残余肝癌的转移能力有所降低,其基因表达改变是一个动态变化的过程,可能与MET基因表达降低,CDKN2A、FAT、COL4A2、TIMP2基因表达增加有关。2.和对照组相比,姑息性手术后残余肝癌的转移能力有所升高。其作用可能与MMP-9、MMP-10、MTA2基因表达增加有关。3.射频消融后联合应用绿脓杆菌制剂（PA2.2×108/d）能够进一步抑制残余肝癌生长转移并延长生存期,其作用可能与HGF基因表达降低,KAI1基因表达增加有关。4.小剂量吲哚美辛（1.5mg/kg·d）+小剂量PA（2.2×108/d）可显著抑制肝癌在裸鼠体内的生长转移,其作用可能与抑制COX-2蛋白表达有关。应用价值1.本研究结果提示,和对照组相比,射频消融未明显增加残余肝癌的转移潜能,而姑息性手术残余肝癌的转移潜能则有所增加,有助于指导临床选择治疗方法,从而提高肝癌的疗效。2.合并应用绿脓杆菌制剂（PA）有助抑制射频治疗后残余肝癌生长转移并延长生存期,为提高射频消融肝癌的疗效提供了线索。3.联合应用消炎痛和PA可显著抑制肝癌的生长转移,有可能成为肝癌治疗的新方法。创新点1.发现射频消融后残余肝癌体内侵袭转移潜能的变化规律,并与姑息性手术相比较,为临床选择治疗方法提供了参考。2.发现射频治疗后合并应用PA能抑制射频治疗后残余肝癌生长转移并延长生存期。3.发现联合应用消炎痛和PA可显著抑制肝癌的生长转移。
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