RGD-蛛丝蛋白工程菌高密度发酵条件的优化及支架材料的细胞相容性研究

论文摘要

蜘蛛丝在生物材料和组织工程领域激起了很大的研究兴趣，本室已利用基因工程方法构建了含有特定细胞黏附信号识别功能的RGD-三肽的重组蛛丝蛋白多聚物pNSR-16／BL21（DE3）plysS，在工程菌摇瓶培养和发酵培养工艺的基础上，采取Do-stat分批补料培养，选择高密度发酵过程中pH、温度、诱导剂和前体物甘氨酸／丙氨酸浓度四个因素，通过正交实验设计对发酵工艺多因素条件进行优化，确立了蛛丝蛋白基因工程菌10L发酵罐高密度发酵的最佳工艺条件。以基因重组蛛丝蛋白为基础原料，与聚乙烯醇多聚物共混，制备组织工程多孔薄膜支架材料。从原核细胞分离纯化重组蛋白，细胞裂解的同时细菌细胞壁内的内毒素也随之释放出来，对蛛丝蛋白支架材料在组织工程学方面的应用有所影响，本文采用物理和化学方法去除内毒素，达到了医学材料的要求。考察了支架材料与细胞的生物相容性，采取NIH3T3细胞与作为细胞外基质的支架材料体外联合培养评价体系。对蛛丝蛋白pNSR-16和天然高分子pNSR-Z支架材料浸提液的生物相容性进行判断，进而考察了支架与NIH3T3细胞的复合培养，评价了二者的黏附及其调节。浸提液实验组和对照组相比，细胞生长没有受到抑制，细胞在材料上粘附生长，实验结果说明蛛丝蛋白材料和细胞之间存在良好的生物相容性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 天然蜘蛛丝的研究进展
• 1.2 人工合成蜘蛛丝
• 1.3 内毒素与基因工程产物
• 1.3.1 内毒素的检测
• 1.3.2 去除内毒素的方法
• 1.4 丝蛋白纤维与细胞外基质
• 1.4.1 复合型细胞外基质
• 1.4.2 电纺丝
• 1.4.3 丝纤维蛋白构建细胞外基质
• 1.5 本研究的背景、目的与意义
• 1.5.1 本研究的背景
• 1.5.2 本研究的目的与意义
• 第2章 正交实验优化RGD-蛛丝蛋白基因工程菌高密度发酵条件
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 正交实验设计
• 2.2.2 工程菌10L高密度发酵流程
• 2.3 结果
• 2.3.1 工程菌高密度发酵的生长曲线
• 2.3.2 目的蛋白的表达量
• 2.3.3 验证优化条件
• 2.3.4 纯化目的蛋白
• 2.4 讨论
• 第3章 膜支架材料中内毒素的去除
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 蛛丝蛋白膜支架材料的制备
• 3.2.2 除去残留于材料的小分子
• 3.2.3 去除内毒素
• 3.2.4 鲎试剂反应前的器具处理
• 3.2.5 鲎试剂法测内毒素
• 3.3 结果
• 3.3.1 支架浸提液pH和离子强度的测定
• 3.3.2 酒精碱处理后支架浸提液内毒素的测定
• 3.3.3 加热处理
• 3.4 讨论
• 第4章 蛋白支架材料的生物相容性实验
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 NIH3T3细胞的培养
• 4.2.2 NIH3T3细胞的冻存
• 4.2.3 细胞计数
• 4.2.4 倒置相差显微镜观察细胞形态
• 4.2.5 制备材料浸提液
• 4.2.6 浸提液培养细胞
• 4.2.7 蛋白支架材料/NIH3T3成纤维细胞的复合培养
• 4.2.8 细胞HE染色
• 4.2.9 MTT实验
• 4.2.10 扫描电镜观察
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 细胞HE染色
• 4.3.2 浸提液细胞培养实验
• 4.3.3 支架复合细胞
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历