论文摘要
本文以筛选具有优良体外发光性能、并对化学污染物敏感的海洋发光细菌为出发点,研究了发光细菌的菌体性质,分离纯化了催化菌体发光的荧光素酶和FMN:NADH氧化还原酶,构建了双酶体外发光的检测体系。在此基础上,利用菌体和双酶进行了食品安全检测的探索研究。1、对海洋发光细菌的菌体性质进行研究。从青岛海域分离纯化了五株海洋发光细菌。经16SrDNA、生理生化试验鉴定,它们分属鳆发光杆菌（P.leiognathi）、哈维氏弧菌（V.harveyi）、明亮发光杆菌（P.phosphoreum）、灿烂弧菌（V.splendidus）和费氏弧菌（V.fischeri）。对五菌株进行发光特性研究和化学污染物敏感性的筛选。结果显示,P.leiognathi YL最大发射波长471nm,持续稳定发光16h,发光性能稳定,且对抗生素和重金属最敏感。优化了P.leiognathi YL的生长发光培养基:0.5%蛋白胨;0.1%酵母浸膏;0.01% FePO4;2-4% NaCl;0.4%甘油;陈海水。最佳发光条件:初始pH 7.5;温度25-30℃;转速150r/min。2、建立了双酶体外发光的检测体系。对五菌株进行跟踪酶活测定,筛选出产酶起始时间早、产酶活力高且稳定的P.leiognathi YL作为双酶的制备菌株。优化了P.leiognathi YL的产酶培养基:0.5%蛋白胨;0.1%酵母浸膏;0.01% FePO4;2-4% NaCl;0.4%甘油;陈海水。最佳产酶条件:初始pH 7.0;温度25-30℃;转速150r/min。建立了单、双酶体外发光检测体系,并对两个体系进行比较。荧光素酶检测体系（室温）: 1mL酶液中,迅速加入底物十二烷醛100μL（27mM）、FMN-Na53μL（10mM）和Na2S2O4 200μL（34mM）,测定酶活。双酶检测体系（室温）:1mL酶液中,一次性快速加入底物十二烷醛100μL（27mM）、FMN-Na53μL（10mM）、NADH 200μL（0.14mM）,测定酶活。双酶体系比单酶体系发光稳定性好,更适合用于检测操作。3、对双酶的酶学性质进行初步研究。超声破碎菌体细胞,通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析得到了电泳纯的FMN:NADH氧化还原酶,测定分子量为28KDa。通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析和DEAE-Sephadex凝胶柱层析得到了电泳纯的荧光素酶,并成功分离出了酶的两个亚基,其分子量分别为41KDa和36KDa。对荧光素酶两个亚基的进行活性测定,结果发现,两个亚基单独存在时无酶活,只有两个亚基同时存在,荧光素酶才有活性。优化了双酶的最适反应条件:温度为35℃,pH 7.0,最适NaCl浓度1.5-2%。K+、Ca2+、Na+、Mg2+离子对酶活有促进作用;Fe2+、Zn2+、Hg2+、Ba2+等离子对酶活有抑制作用。抗生素对双酶基本无影响。双酶的热稳定性较好。4℃下可长时间保持酶活。随着温度升高,双酶的耐热性变差,且酶失活的时间缩短。4、菌体在食品安全检测中的应用探索。建立了P.leiognathi YL检测水产品中氯霉素残留的方法体系。选取对数生长期的P.leiognathi YL,控制菌数为107cfu/mL,乙酸乙酯提取氯霉素,5mL菌液中加入5mL氯霉素提取液,27℃150r/min培养30min,测定发光抑制率。检测线性范围0.14-1.0μg/L,方法检出限0.14μg/kg。建立了P.leiognathi YL检测水产品中重金属的方法体系。重金属敏感性筛选结果显示,P.leiognathi YL对Hg2+、Cr6+、Cd2+最敏感。选取对数生长期的P.leiognathi YL,控制菌数为107cfu/mL,样品灰化处理后,5mL菌液中加入5mL重金属提取液,27℃150r/min培养30min,测定发光抑制率。Hg2+检测线性范围0.007-0.28μg/L,方法检出限为0.007μg/kg;Cr6+检测线性范围0.9-30.0μg/L,方法检出限为0.9μg/kg;Cd2+检测线性范围5.4-65.0μg/L,方法检出限为5.4μg/kg。5、双酶在食品安全检测中的应用探索。建立了双酶检测水产品中重金属残留的方法体系。重金属敏感性筛选结果显示,双酶对Hg2+、Cr6+最敏感。样品灰化处理后,1mL酶液中加入500μL样品溶液,4℃放置反应15min,测定酶活抑制率。Hg2+检测线性范围0.0007-0.030μg/L,方法检出限0.0007μg/kg;Cr6+检测线性范围0.05-5.0μg/L,方法检出限0.08μg/kg。初步研究了大肠杆菌内NADH对双酶酶活的影响。测定了NADH含量对双酶酶活的影响曲线。在此基础上,对不同菌量的大肠杆菌进行超声细胞破碎,释放NADH,进行双酶酶活检测,为今后利用双酶检测大肠杆菌的菌数提供基础理论数据。