论文摘要
背景与目的:肺癌是严重威胁人类健康的疾病之一,迄今为止,仍未找到满意的治疗方法,因此寻求新的抗肿瘤方法尤为重要。浸润和转移是恶性肿瘤的重要特征,也是恶性肿瘤难以治愈、导致患者死亡的关键问题。肿瘤血管是恶性肿瘤生长、侵袭和转移的基础。肿瘤的血管形成不但与肿瘤细胞的营养和供氧程度有关,而且也反映了肿瘤的侵润和转移能力,是决定肿瘤大小、转移、复发和预后的重要因素。包括肺癌在内的大部分恶性肿瘤的生长和转移都有血管形成依赖性的特点。肿瘤微血管密度(micro vascular density,MVD)被公认为是反映肿瘤血管生成最有效的客观指标,已经广泛的被认为是判断肿瘤预后的重要因素。跨膜糖蛋白(CD105)主要表达在处于增殖状态的血管内皮细胞表达,是新生血管内皮细胞特异性标志物。此外CD105通过调节TGF-β的活性,促进血管内皮细胞的增殖、分化和迁移,参与血管的生成。骨形态发生蛋白(BMPs)属于(transforming growth factor-β)转化生长因子-β超家族中的细胞因子,是一组广泛参与调节多种细胞的增殖、分化和凋亡的生物学过程的功能蛋白,能诱导前体细胞的迁移和分化,调节细胞的生长、增殖、迁移和胚胎干细胞的自我更新。目前大部分研究都认为BMP-2在恶性肿瘤的生长、侵袭、迁移中有非常重要的促进作用。目前有关BMP-2在肺癌中表达情况的研究甚少,国内目前尚未见报道。BMP-2与肺癌的关系亦尚不十分明确。为进一步探讨BMP-2和CD105标志的MVD与肺癌浸润、转移和血管形成的关系,寻求早期检测肺癌浸润和转移的指标及寻找抑制肺癌发生和浸润转移的有效方法。本研究课题应用免疫组织化学方法和免疫印迹法,检测肺癌细胞中BMP-2的肺癌组织中BMP-2和CD105标志的MVD的表达情况,同时使用RT-PCR方法测定非小细胞肺癌(NSCLC)中BMP-2基因mRNA表达水平情况,并分析两者的的表达水平与肺癌临床及病理学特征之间的关系。方法:1.免疫组织化学方法:检测BMP-2及CD105在50例非小细胞肺癌组织和10例正常组织中的表达情况,所选择病例术前未经任何化疗和放疗。2.免疫印迹(Western Blot)法检测20例非小细胞肺癌组织和10例正常组织中BMP-2的表达情况,及其肺癌临床分期的关系。3.反转录-PCR (RT-PCR)检测mRNA的表达。采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。1%琼脂糖电泳鉴定其完整性。RT-PCR方法:反转录合成cDNA,建立PCR反应体系,94℃预变性5min,然后94℃变形45s,52℃退火45s,72℃延伸60s,共30个循环,最后72℃延伸10min。30次循环扩增,PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳(90V,35mi n)。紫外分析仪观察并照相。统计学处理:所有结果均采用SPSS13.0软件进行分析,免疫组化法BMP-2蛋白表达阳性率的分析比较进行X2检验;肿瘤MVD的标志CD105及其与BMP-2之间关系的分析进行t检验,检验水准α=0.05;Western Blot结果和RT-PCR结果进行方差分析,P<0.05有统计学意义结果:1.BMP-2在组织中的表达:在肺癌组和正常组织组中显示BMP-2在非小细胞肺癌组表达阳性率68%,明显高于对照组正常肺组织中的表达率0%(P<0.05)。在非小细胞肺癌临床病理特征组中显示:Ⅰ期+Ⅱ期阳性表达率为53.6%,低于Ⅲ期-Ⅳ期的阳性表达率86.4%(P<0.05);BMP-2蛋白在低分化的肺癌中阳性表达率为85.0%,明显高于中高分化肺癌组织中阳性表达率56.7%(P<0.05);有淋巴结转移的阳性表达率为78.1%,高于无淋巴结转移组50%%(P<0.05);然而在性别、年龄和不同组织类型组之间的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.MVD的标志CD105在组织中的表达:NSCLC组织中MVD值为41.32±4.52,正常肺组织中,MVD值为30.12±3.21,两组差异比较有统计学意义(P<0.05)。在NSCLC中,I+11期患者组的MVD值(35.63±4.31)低于Ⅲ+Ⅳ期患者的MVD值44.80±4.61(P<0.05);有淋巴结转移组的MVD值为47.31±4.94高于无淋巴结转移组的MVD值34.61Q4.19(P<0.05)。而在高中分化NSCLC组的MVD值为38.63±4.8低于低分化组的MVD值41.27±4.23(p>0.05);然而在性别、年龄和不同组织类型以及肿瘤分化程度中的表达比较无统计学意义(P>0.05)。3.非小细胞肺癌组织中MVD的标志CD105和BMP-2表达的关系:BMP-2阳性组的MVD值(42.46±3.75)大于BMP-2阴性组的(33.28±3.21),二者的差异有统计学意义(P<0.05)。4. Western Blot法检测可见BMP-2在非小细胞肺癌组织中均呈高表达,在正常组织中表达水平很低。BMP-2蛋白各组相对OD值:鳞状细胞癌组为1.869±0.032;腺瘤癌为2.278±0.041;正常组织组为0.199±0.027。经单因素方差分析发现,鳞状细胞癌组与腺癌组的BMP-2蛋白表达水平差异无统计学意义(p>0.05),经鳞癌和腺癌组分别与正常组织组比较差异均有统计学意义(P<0.01),检测结果与免疫组化法结果相符(见表5)。5. RT-PCR法检测BMP-2 mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达情况。10例正常组织和20例肺癌组织中分别有2例和17例可以检测到BMP-2mRNA表达,阳性表达率分别为20%和85%。经过χ2检验,正常组织和非小细胞肺癌组织中BMP-2基因mRNA阳性表达率有统计学意义(p<0.05)。结论:(1)结果显示BMP-2基因和蛋白均在正常肺组织中低表达,而在非小细胞肺癌组织中呈高表达;且BMP-2蛋白表达水平的高低与非小细胞肺癌有无淋巴结转移、临床分期、分化程度相关。BMP-2蛋白表达升高与非小细胞肺癌的发生密切相关,但与其病理类型无关。表明BMP-2蛋白和基因的高表达可能与在非小细胞肺癌的侵袭、转移和血管的生成过程中起促进作用。(2)标志MVD的CD105在非小细胞肺癌组织中呈现高表达,而在正常肺组织中低表达;MVD值的高低与非小细胞肺癌的肿瘤临床分期和有无淋巴结转移有关,与患者年龄、性别和NSCLC的分化程度、病理分型无关。提示CD105可能在非小细胞肺癌的肿瘤血管形成、侵袭和转移起中介作用。(3)BMP-2与MVD在非小细胞肺癌组织中的表达中呈现正相关关系,表明两者在非小细胞肺癌的侵袭、转移、尤其是血管生成中可能存在相互关联作用。
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标签:非小细胞肺癌论文; 骨形成蛋白论文; 肿瘤微血管密度论文; 免疫组化论文; 蛋白质免疫印迹法论文;