PPARγ与GST的融合表达及在微纳米磁珠表面固定化

论文摘要

基于将靶蛋白固定在磁性微纳米材料表面，通过磁分离和色谱分析快速测定未知含量混合物中候选配体亲和力的组合库筛选新技术,可高效低成本高通量进行快速筛选，寻找靶蛋白的高亲和力配体。本文利用原核表达载体pGST-MOLUC系统带有编码分子量约为26KD日本血吸虫GST的表达纯化标签，通过紧随其后的多克隆位点，插入所需的目的基因片段PPARγ的配体结合域（LBD），并使之形成与GST具有相同读码框的融合蛋白，进一步纯化获得靶蛋白，试图通过人源PPARγ建立模型来探索磁珠固定化靶蛋白方案，建立磁分离筛选技术，快速筛选PPARγ的高亲和力配体。1.带GST标签的融合蛋白PPARγ-LBD的重组表达首先基因克隆构建重组载体GST-hPPARγ-LBD，在大肠杆菌中成功表达并进行纯化，获得了纯度约90%的可溶性蛋白，检测其与亲和配体罗格列酮的特异结合百分比为66.12%，证明具有配体结合活性，为后续PPARγ功能活性的研究及建立磁分离技术筛选其高亲和配体奠定基础。2.磁珠固定化靶蛋白，考察靶蛋白在磁珠上的保留活性本文选择未融合靶蛋白的标签GST作磁珠表面固定化考察其活性保留。分别尝试氨基固定化和巯基固定化，游离试剂SS-mPEG和N-乙基马来酰亚胺分别对标签GST的氨基和巯基进行修饰，GST剩余活性均在60%以上，但当固定在亲水磁珠表面后其保留活性在1%5%之间，暂时达不到要求，固定化工艺尚待优化。3.筛选标签GST的高亲和力配体，探索亲和试剂的设计先利用GST活性测定方法分别测得其对相应两个底物GSH和CDNB的Km，此标签GST对GSH的Km为0.11mmol/L，对CDNB的Km为0.69mmol/L。GST反应存在明显产物抑制，固定GSH浓度时GS-DNB对GST为竞争性抑制常数Ki为（4.8±0.4） μmol/L （n=2），固定CDNB浓度时GS-DNB对GST的非竞争性抑制Ki为（34±3） μmol/L（n=2）。GS-DNB对该标签GST的抑制效力与其对猪肝碱性和酸性GST同工酶都相差很大（P <0.05）。进一步使用酶动力学初速度法测定一系列丁二胺的衍生物，其中与标签GST亲和力最高的是丁二胺与依他尼酸连接的衍生物N,N’-双依他尼酰-1,4-丁二胺，抑制效力在nmol/L级，与未连接丁二胺的依他尼酸相比提高近3个数量级；其次为对丁基苯甲酸与丁二胺的衍生物N,N’-双对丁基苯甲酰-1,4-丁二胺。选择上述高亲和力配体，添加可与标签蛋白活性位点氨基酸残基共价连接的官能团，获得针对标签活性位点的亲和标记试剂；将此类亲和标记试剂固定化在亲水磁珠表面，可用于对应标签活性位点的亲和标记，从而将与标签融合的靶蛋白位点选择性地固定化在磁珠表面，用于筛选靶蛋白的混合物配体库。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 带 GST 标签的 hPPARγ-LBD 重组表达
• 1 材料与方法
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 标签 GST 在微纳米磁珠表面的固定化
• 1 材料与方法
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 标签 GST 的制备及其亲和配体的筛选
• 1 材料与方法
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢