论文摘要
人乳头瘤病毒(human papilloma virus HPV)的感染是宫颈癌发生的必要条件,其中50%以上是HPV16型。HPV的E6和E7基因整合到宫颈上皮细胞并持续表达是引发宫颈癌的主要原因,同时也是维持宫颈癌恶性表型的必要条件。目前阻断细胞内整合型E6的表达主要使用反义核酸和靶向性核酶技术,但这两种方法的抑制效率不高。因此寻找更有效阻断的方法,对探索E6致癌及维持宫颈癌恶性表型的下游机制具有重要的意义。由于传统方法在晚期宫颈癌的疗效有限,近年来宫颈癌生物治疗的研究显示了很诱人的应用前景。由于宫颈癌细胞中整合的HPV致癌基因与人体自身基因无同源性,因而成为理想的生物治疗靶标。RNA干扰技术是通过双链RNA来阻断目的基因的表达,使用经细胞内转录后形成的发夹状短链干扰RNA(small hairpin RNA,shRNA),抑制靶基因的持续时间可达7天以上,同时很便于进行实验动物的体内研究。慢病毒的感染效率高、激发免疫反应的作用弱,是携带干扰RNA理想载体。目前以慢病毒为载体的shRNA抑制宫颈癌细胞中E6的表达尚未见文献报道,因此我们设计了三条靶向HPV16 E6的shRNA表达序列,将其克隆到慢病毒工作质粒PLL3.7中并经酶切和测序鉴定。PLL3.7与三种混合包装质粒以lipofectamine 2000包裹后转染293FT细胞,由此产生shRNA重组慢病毒。以慢病毒感染宫颈癌Caski细胞后,检测癌细胞中HPV16 E6表达的变化,与E6致癌相关基因P21和P53表达的变化;观察细胞增殖能力和侵袭能力的变化。分别将shRNA处理的Caski细胞和对照Caski细胞种植于裸鼠皮下,观察两组细胞的成瘤能力。以Caski细胞种植于裸鼠皮下,待肿瘤形成后注射shRNA重组慢病毒,观察移植瘤的生长抑制情况;E6、P53和P21蛋白表达的变化。研究结果如下。1. 293FT细胞包装出的慢病毒滴度为5×10~6TU/ml,浓缩后其滴度可达108TU/ml,其感染Caski细胞的最佳MIO为2.5。2.慢病毒感染后,Caski细胞中HPV16 E6 mRNA的含量下降80%,E6蛋白的表