油菜BN5和BN10基因的诱导表达和病毒抗性鉴定及拟南芥遗传转化

论文摘要

油菜是我国重要的油料作物。病毒病是危害油菜的主要病害,芜菁花叶病毒（TuMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、油菜花叶病毒（YOMV）和烟草花叶病毒（TMV）是油菜病毒病的主要毒源。在油菜生产上,种植抗病品种是防治病毒病的有效措施,但目前尚缺乏对病毒病高抗或免疫的油菜品种,并且寄主对病毒病抗性的分子机制研究相对滞后。本研究利用基于病害防御反应信号分子诱导处理的油菜叶片制备的UniGene库和对应的油菜cDNA芯片,通过基因表达谱分析和序列分析,结合参阅相关文献,挑选出与抗病抗逆相关的油菜BN5基因和BN1O基因；利用农杆菌介导的泡花法（Floral-dip）将油菜BN5和BN10基因转化到Columbia野生型拟南芥；利用荧光定量PCR检测BN5和BN10基因在油菜不同组织中的表达差异,以及病毒和化学处理对该基因的诱导表达。取得的主要研究结果如下：1.YOMV、TuMV和CMV三种病毒在油菜感病品种华杂6号上活化后的病状表现基本一致,表现为花叶、斑驳、疱斑、明脉和皱缩等症状。病毒接种鉴定结果显示,转BN5基因RNAi载体的转基因油菜（pRNAi-BN5）比非转基因对照（苏油1号）对病毒更敏感。在三种油菜病毒中,转基因油菜对CMV最为敏感,接种CMV后发病最重,其次是YOMV和T’uMV。2.pRNAi-BN5转基因油菜中BN5基因荧光定量PCR分析表明：BN5基因的表达受到明显抑制,表达量仅为非转基因对照的22%-45%。BN5基因在转基因和非转基因油菜根、茎、叶中均有表达,其中在茎的表达量最高,叶居中,根的表达量最低。油菜接种YoMV、CMV和TuMV,不管是转基因油菜还是非转基因油菜,三种病毒均能诱导BN5基因的上调表达,但不同时间点的表达量和上调表达幅度有所不同。三种病毒中,接种CMV时BN5的诱导表达量最高,且最先达到峰值,但之后迅速下降,降幅大于接种YOMV和TuMV时BN5的表达量。说明BN5基因对CMV的刺激最敏感,可能在油菜抗病毒过程中发挥了重要作用。3.BN10基因在油菜根、茎、叶中均有表达,其中在根的表达量最高,茎居中,在叶中的表达量最低。用甲基茉莉酸（MeJA）和草酸（OA）处理油菜叶片,荧光定量PCR分析表明：MeJA诱导处理后BN10基因表达先升后降,在24h表达量最高（为诱导前的2.58倍）,之后有所下降,但诱导后的表达量始终高于诱导前,72h时的表达量仍为诱导前的1.13倍。OA诱导处理后,BN10表达量也是先增加后降低,在12h达到最大值（为诱导前的2.5倍）,72h下降至最低（仅为诱导前的25%）。研究结果显示,甲基茉莉酸和草酸均能诱导BN10的表达,推断BN10可能在油菜抗逆过程中具有一定的作用。4.通过化学法（CaCl2法）将油菜BN5和BN10基因的RNAi载体和过表达载体,即pRNAi-BN5、pG4A-BN5、pRNAi-BN10和pG4A-BN10 4种质粒DNA成功转化农杆菌EHA105。通过除草剂筛选及PCR检测,分别获得含pRNAi-BN5、pG4A-BN5、pRNAi-BN10和pG4A-BN10质粒的T0代转基因拟南芥20株、10株、7株和10株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 植物对油菜三种病毒的研究现状
• 1.1 油菜三种病毒简介
• 1.2 植物对油菜三种主要病毒的抗性研究
• 2 植物抗病毒基因SGS3的研究现状
• 2.1 SGS3基因的发现
• 2.2 SGS3基因的结构和特征
• 2.3 SGS3基因的抗病毒反应
• 3 植物GST抗逆基因的研究现状
• 3.1 植物GST的结构和特性
• 3.2 GST抗逆基因的诱导和功能
• 4 转基因拟南芥的研究概况
• 4.1 拟南芥的遗传转化方法
• 4.2 转基因拟南芥的筛选与检测
• 5 本研究的目的及意义
• 第二章 油菜BN5和BN10基因的诱导表达和抗病毒鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物毒源
• 1.1.2 油菜品种
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 除草剂筛选转基因油菜
• 1.2.2 间接ELISA检测活化病毒种类
• 1.2.3 病毒接种及鉴定方法
• 1.2.4 化学诱导处理
• 1.2.5 取样
• 1.2.6 植物总RNA的提取
• 1.2.7 RNA反转录为cDNA
• 1.2.8 以cDNA为模板进行PCR扩增
• 1.2.9 荧光定量PCR
• 1.2.10 数据处理方法
• 2 结果与分析
• 2.1 除草剂喷施油菜试验结果
• 2.2 植物病毒活化样品检测结果
• 2.3 转基因油菜对三种病毒的抗性鉴定
• 2.4 油菜总RNA质量检测
• 2.5 RT-PCR检测
• 2.6 荧光定量PCR分析
• 2.6.1 PCR条件优化和特异性产物扩增
• 2.6.2 YoMV接种诱导后BN5表达的动态变化
• 2.6.3 CMV接种诱导后BN5表达的动态变化
• 2.6.4 TuMV接种诱导后BN5表达的动态变化
• 2.6.5 三种病毒接种诱导后BN5表达变化的差异比较
• 2.6.6 油菜不同营养器官中BN5和BN10的相对表达水平
• 2.6.7 甲基茉莉酸和草酸诱导BN10在油菜叶片中表达的动态变化
• 3 小结与讨论
• 3.1 Q-PCR技术检测基因表达动态变化的应用
• 3.2 油菜BN5基因在不同组织中的表达及病毒的诱导表达
• 3.3 油菜BN10基因受化学处理的诱导表达
• 第三章 油菜BN5和BN10基因转化拟南芥
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 植物材料
• 1.1.4 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒DNA的提取
• 1.2.2 农杆菌感受态的制备
• 1.2.3 质粒DNA转化农杆菌
• 1.2.4 引物设计
• 1.2.5 转化子农杆菌菌液PCR检测
• 1.2.6 大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.7 质粒DNA转化大肠杆菌
• 1.2.8 质粒DNA的限制性酶切
• 1.2.9 质粒DNA转化拟南芥
• 1.2.10 除草剂筛选T0代转基因拟南芥
• 1.2.11 T0代转基因拟南芥基因组DNA提取
• 1.2.12 T0代转基因拟南芥PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒DNA的电泳检测
• 2.2 农杆菌转化子菌液PCR检测
• 2.3 农杆菌菌液提取质粒DNA的电泳检测
• 2.4 重转大肠杆菌菌液中质粒DNA的电泳检测
• 2.5 重转大肠杆菌菌液中质粒DNA的酶切鉴定
• 2.6 质粒DNA转化拟南芥
• 2.6.1 T0代转基因拟南芥的筛选
• 2.6.2 T0代转基因拟南芥的PCR鉴定
• 3 小结与讨论
• 3.1 不同基因转化农杆菌表现差异
• 3.2 Floral dip法应用于十字花科植物的遗传转化
• 3.3 转基因拟南芥有待进一步研究
• 第四章 全文结论与展望
• 参考文献
• 附录 主要试剂及溶液的配置
• 致谢