低频超声与小剂量缓激肽联合应用开放血肿瘤屏障机制的研究

论文摘要

前言血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）是维持脑内物质转运平衡的重要结构,严格限制大分子物质与98%的小分子物质进入中枢神经系统。与BBB结构类似,脑胶质瘤细胞与微血管之间存在着血肿瘤屏障（blood-tumor barrier,BTB）,是位于内皮细胞之间由一些复杂的紧密连接（tight junction,TJ）蛋白系统构成的限制亲水性物质跨过的细胞旁屏障。TJ蛋白系统是由claudins、occludin和ZO-1等多种TJ相关蛋白构成的复杂连接。BTB的通透性略高于正常的BBB,但仍具有屏障的功能。BTB的存在是限制抗肿瘤药物疗效的关键。研究者们已经尝试采取多种方法提高药物通过BTB的通透性,如使用高渗性药物甘露醇、设计能跨过屏障的药物或载体、直接将药物注射入脑、用导管经动脉分支给药、经鼻腔给药等,但是这些方法因受使用剂量大、有一定创伤性、安全性低、开放时间短等诸多条件的限制而难以得到临床应用。低频超声（low-frequency ultrasound,LFU）是临床诊断中的常规手段之一。由于LFU具有在组织中易穿透,声能吸收少,对组织损伤小的特点,近年来,国内外学者也开始将LFU用于实验性治疗的研究中。LFU已经应用于骨关节病及感染和炎症的治疗、促进骨折愈合、溶栓、软组织修复及抗肿瘤细胞治疗等实验性治疗研究。最近,国外研究发现,LFU作用于脑组织可以引起BBB的开放,采用的超声频率范围为260 kHz～1.63 MHz,也有选用最大频率为3.5 MHz的报道。研究显示,LFU也可以提高药物在脑内的通透性,但目前仍处于实验阶段,超声条件还没有统一的参数标准。我们的前期研究工作表明,在1 MHz、12 mW、声压0.48 MPa和作用时间为20 s的条件下进行LFU辐照能够可逆性开放BBB的同时,对正常神经元没有产生明显损伤。考虑到肿瘤术后骨窗,便于超声辐照,上述研究提示LFU有可能成为研究可逆性开放BTB的新方法。目前关于LFU开放BBB或BTB的机制尚不清楚。有报道灌注小剂量缓激肽（bradykinin,BK）可能通过与胶质瘤细胞上的B2受体结合,选择性开放BTB,增加抗肿瘤药物卡铂到达脑肿瘤组织,有效延长脑恶性胶质瘤的生存期。但是,研究发现,BK还有一些缺点,如剂量较大时有明显的降血压作用,并且由于BK可被快速降解,使得其增加BTB通透性的时间很短暂,因而临床应用受限。因此,探寻提高缓激肽作用效果和时间的方法是目前的研究方向。本研究尝试单独应用LFU辐照,或者LFU和小剂量BK联合应用的方法,研究对BTB通透性的影响,以及开放BTB细胞旁途径的机制;同时研究二者单独应用和联合应用时,三种BTB的TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA和蛋白表达的变化,探讨其可能的机制,并力图寻求安全、较长效地开放BTB的二者联合应用的剂量。方法1、建立有超声透声窗的大鼠BTB模型。2、应用伊文氏兰（Evans blue,EB）渗透法检测LFU与BK单独或联合应用前后脑胶质瘤大鼠BTB渗透性的变化。3、应用透射电镜技术观察LFU与BK单独或联合应用前后脑胶质瘤微血管内皮细胞间TJ及脑胶质瘤等超微结构的改变。4、应用RT-PCR法检测LFU与BK单独或联合应用前后脑胶质瘤大鼠TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA表达的变化。5、应用免疫组织化学法检测LFU与BK单独或联合应用前后脑胶质瘤大鼠TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的分布和表达的变化。6、应用免疫荧光法检测LFU与BK单独或联合应用前后脑胶质瘤大鼠TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的分布和表达的变化。7、应用western blot法检测LFU与BK单独或联合应用前后脑胶质瘤大鼠TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1蛋白表达的变化。结果1、LFU辐照后,C6脑胶质瘤大鼠的BTB通透性增加,在1.5 h达到峰值,12 h恢复正常水平。2、LFU辐照引起C6脑胶质瘤大鼠TJ开放;对神经元无明显损伤,同时诱导C6胶质瘤细胞凋亡。3、LFU辐照后,TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA表达显著减少;其减少的趋势为在1.5 h时达最低值,12 h以后逐渐恢复正常。4、LFU辐照后,C6脑胶质瘤大鼠脑组织中微血管内皮细胞上的TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表达减少;其减少的趋势为在1.5 h时达最低值,12 h以后逐渐恢复正常。5、LFU与BK单独应用后,BTB的通透性显著增加;二者联合应用后,BTB通透性进一步增加。6、LFU与BK单独与联合应用后,透射电镜均可显示C6脑胶质瘤大鼠TJ开放。7、LFU与BK单独应用后,TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA表达显著减少;二者联合应用后TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA表达进一步显著减少。8、LFU与BK单独应用后,TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的蛋白表达显著减少;二者联合应用后TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的蛋白表达进一步显著减少。讨论本研究证实,LFU辐照能显著增加BTB的通透性,可逆性开放BTB。此过程中LFU对神经元无明显损伤;能够诱导C6胶质瘤细胞凋亡。LFU和BK单独应用和联合应用显著增加了C6胶质瘤大鼠BTB的通透性,透射电镜显示BTB上的TJ开放。同时,TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA和蛋白的表达水平显著下降。联合应用组中的5/6LFU+2/3BK组和LFU+BK两组与LFU组和BK组相比,BTB的通透性增加,TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表达进一步下降。提示5/6LFU+2/3BK组和LFU+BK组能够更显著地开放BTB。TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA和蛋白的表达水平的显著下降可能是LFU和BK单独应用和联合应用开放BTB的主要分子机制之一。在前期研究中,我们证明了采用LFU能够可逆性开放BBB（power=12 mW,pressure=0.48 MPa,frequency=1 MHz,exposure deep=5mm,exposure time=20s）。有报道LFU能够提高脑组织对抗体或其它正常情况下难以入脑的药物的通透性,可以靶向性地将阿霉素、gadolinium等转运入脑。这些研究提示LFU能够可逆性开放BBB和BTB。为了进一步研究LFU增加BTB通透性的机制,本研究用透射电镜观察了与我们前期报道相同的辐照条件下1.5 h时,BTB上血管内皮细胞之间的TJ的变化,发现TJ明显开放,提示细胞旁途径—TJ的开放是BTB通透性增加的机制之一。与我们研究结果相似的有报道采用690 kHz,1 Hz,20 s参数的超声辐照,超声辐照声压在0.4 MPa～3.1 MPa范围内变化时,电镜下观察到辣根过氧化物酶（HRP）能够经跨细胞和细胞旁途径穿过血管壁。关于LFU开放BBB和BTB的确切机制,目前尚不清楚。有报道低强度超声（f=1.029 MHz,power=0.2 W）可通过血管收缩改变脑血流来改变BBB的通透性。辐照时间为20 s时起主要作用的是空化效应,造影剂引起的BBB开放可以在体内稳态空化、宽频发射及溢出都不存在的情况下发生,可能来源于超声与微泡之间的相互作用,与LFU的造影剂产生的二次及三次谐波信号的增加有关。造影剂Optison能够与LFU联合作用开放BBB,但是对脑组织几乎没有损伤。应用260 kHz-1.63 MHz LFU可逆性开放BBB或BTB时,有脑组织缺血,毛细血管红细胞漏出、神经元凋亡等副作用。本研究显示小剂量BK能显著增加BTB对EB的通透性,可选择性开放BTB内皮细胞的TJ,通过细胞旁途径选择性增加BTB的通透性。这与一些报道结果一致。BK还通过其它机制如开放KATP通道和KCa通道引起BTB通透性的增加。但是BK引起BTB通透性的增加通常是短暂的,最佳作用峰值时间为15-30 min,60 min后恢复至正常水平。有研究显示BK引起的BTB通透性的短暂增加可能是由于B2受体的神经支配导致的快速耐受所致。为了减少LFU和小剂量BK开放BBB或BTB的副作用,探讨可能的应用途径,我们在本研究中探讨了LFU和小剂量BK联合应用的可能性和相关机制。研究结果显示,在LFU和BK联合应用组,BTB通透性显著高于对照组,血管内皮细胞间的TJ开放,提示在增加BTB通透性上,存在协同作用。为了初步研究LFU和BK联合应用的可能机制,我们研究了BBB细胞旁途径的最主要结构TJ的变化。TJ是一个维持动态平衡的稳定结构,能被各种细胞外的刺激诱导快速解聚和重组。本研究应用RT-PCR和免疫荧光、组化以及western blot等方法从mRNA和蛋白表达水平证明了LFU和BK联合应用时的协同作用。关于LFU对脑血管内皮细胞间TJ的影响及机制报道不多,尚无定论。有报道LFU能通过瞬态空化效应产生的机械剪切力损伤细胞膜,引起细胞膜上的TJ相关蛋白结构的完整性破坏,蛋白表达水平减少。国外学者在LFU（1.5 MHz）辐照后4 h内,应用免疫电镜技术观察到TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1表达减少,6-24h以后逐渐恢复正常,这与我们的研究结果相似。但是LFU引起claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA表达水平下降尚未见报道。总之,本研究证明了LFU能增加BBB和BTB的通透性,可逆性开放BBB和BTB的TJ。引起TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA和蛋白的表达水平显著下降。本研究首次证明了LFU和BK联合应用在增加大鼠BTB的通透性上存在协同作用,BTB上的TJ开放。TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的mRNA和蛋白的表达水平显著下降。关于LFU和BK联合应用引起TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1 mRNA和蛋白水平降低的机制有待进一步研究。本研究结果为可逆性开放BTB提供了新途径。结论1、超声参数为频率1 MHz、强度12 mW、声压0.48 MPa和作用时间20s的LFU是可逆性地开放BTB的适宜条件。2、LFU在显著地增加BTB的通透性的同时,能可逆性地开放BTB的TJ;LFU在开放BTB的条件下对神经元无明显损伤,能够诱导C6胶质瘤细胞凋亡。3、LFU辐照能使TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1在mRNA和蛋白水平的表达显著减少,此作用与LFU诱导TJ开放相关。4、LFU与BK联合应用能以协同作用的方式显著增加BTB的通透性。5、LFU与BK联合应用能以协同作用的方式显著减少TJ相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1在mRNA和蛋白水平的表达。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一 低频超声开放血肿瘤屏障机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 论文二 低频超声与小剂量缓激肽联合应用开放血肿瘤屏障机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间的科研成绩
• 致谢
• 个人简介